基于CRISPR/Cas技术的传染性病原精准便携化检测系统

以核酸为检测靶向的分子诊断方法是传染性病原体检测的金标准,但将其应用于便携化或现场快速诊断时仍存在多种限制和挑战,如特异性差、操作繁琐和便携化难等。规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）-荧光检测方法有望大幅提升核酸识别的特异性和信噪比。本研究开发了环介导等温扩增（LAMP）-CRISPR/Cas-便携化灰度读取仪检测系统。在CRISPR RNA (crRNA)存在下,利用CRISPR/Cas12a体系实现了对自主设计的甲型和乙型流感病毒核酸LAMP扩增反应体系的精准荧光检测,验证了CRISPR/Cas体系的高选择性和通用性。配套自主开发的便携化灰度读取仪,可同时实现荧光信号的低成本采集和高可靠性可视化判读,检测结束后直接输出样品的阳/阴性结果。利用本检测系统对实际样本进行了分析,验证了其可靠性和实用性,证明了本系统能够实现流感病毒的高灵敏、高特异性便携化分析。     

发卡型万能传导在基于核酸分子线路的基因诊断中的应用和性能优化

核酸等温扩增技术作为核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定温度下。与聚合酶链反应相比,核酸等温扩增反应具有优异的便携型,因而被视为最有望实现基因快检甚至即时快检的体外基因扩增方法。然而,由于反应过程中假阳性扩增频发、反应后对产物的检测方法缺乏特异性和灵敏度等缺点,限制了其在实际分析检测中的应用。通过构建发卡型结构万能中转探针,成功地将恒温扩增产物转到一套性能良好的已知核酸分子线路上;借助核酸分子线路的百倍放大性能和序列特异性,实现对上游基因序列信息的精准识别和放大信号输出。针对不同的待测序列,仅需改变发卡型中转探针的序列,即可实现对不同序列目标物的检测。基于中转探针的重要性,本研究对中转探针的设计原理和方法进行了重点阐述,提出并验证了一套行之有效的普适性设计规律,确保中转探针良好的中转效率(信噪比)。利用这一规律获得的中转探针,与核酸分子线路偶联,可成功为低至近单分子(20个拷贝)的模型基因提供显著荧光和电化学信号输出。