外源乳酸脱氢酶基因在双歧杆菌中的表达

以大肠杆菌 双叉双歧杆菌的穿梭质粒pHJ为基础,插入从Lactococcuslactis总DNA中用PCR方法扩增得到的报告基因乳酸脱氢酶基因(ldh),构建了双叉双歧杆菌的表达质粒pHJ LDH,并采用电转化法导入双叉双歧杆菌进行了表达研究.对双叉双歧杆菌总蛋白的SDS PAGE分析结果表明,ldh报告基因的表达产物形成了明显的条带,Western blotting结果确认了该条带为ldh基因的产物.LDH的酶活性定量测定结果表明,重组双叉双歧杆菌的蛋白粗抽提液中LDH的比活性为5.5U/mg,菌中LDH的表达量约为2mg/L.此工作为今后双叉双歧杆菌的基因工程奠定了基础.     

T7 DNA 聚合酶基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应技术，从T     

堆载下被动桩与土体相互作用的FLAC三维分析

被动桩问题是近年来岩土工程领域的一个研究热点,但是对于堆载下桩、土之间复杂的相互作用一直缺乏系统的三维分析。本文采用FLAC3D建立了有限差分模型,对单排桩三维工作性状进行分析,重点研究堆载条件、桩身刚度及土层分布对桩身位移和桩侧土压力的影响情况,并籍此对软土地基的桩、土共同作用机理加以阐述,得出一些有益结论。分析表明,软土地基中桩侧土压力的分布可简化为线性模式,本文对此进行了线性拟合。     

利用大肠杆菌工程菌生产2,3-二磷酸甘油酸的研究

通过基因工程的方法,将表达人源BPGM(bisphosphoglycerate mutase二磷酸甘油酸变位酶,E.C.2.7.5.4.)的质粒转化入大肠杆菌内,并进行培养条件的优化摸索,通过向培养基内加入葡萄糖使大肠杆菌大量发酵生产2,3-BPG(2,3-bisphosphoglycerate,2,3-二磷酸甘油酸).结果表明,当培养基中葡萄糖质量浓度为10 g/L,诱导时间为4 h,大肠杆菌工程菌表达的2,3-BPG含量最高.如果诱导后加入终质量分数为0.5%的Tween 80可以有效促进2,3-BPG分泌到培养基中.诱导后4 h添加新培养基,补加葡萄糖可以使2,3-BPG的产量提高1倍,达到7.5 mmol/L.     

反相高效液相色谱对DABTH—氨基酸的分离与鉴定

应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术,采用等度洗脱。对20种标准DABTH-氨基酸进行了分离与鉴定,灵敏度达到pmol水平;并以溶菌酶为模式蛋白,经手工DABITC/PITC双偶联方法对其N端部分序列进行Edman降解,其降解产物DABTH-氨基酸用RP-HPLC技术进行了鉴定,蛋白质微量序列分析的灵敏度达到nmol水平.     

丝心蛋白基因分子克隆与表达的初步探讨

通过聚合酶链反应扩增丝心蛋白Ｃ亚基结构的基因，并将基克隆到融合蛋白表达载体ｐＲＩＴ２Ｔ质粒中得到ｐＲＩＴ２Ｔ－ＦＬ质粒，在大肠杆菌株Ｐ２３９２内进行表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹反应证明融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达。     

Subunit Structure and Conformation of Bombyx Mori Silk Proteins

Molecular weights of the silk fibroin were determined by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of so-didium dodecyl sulfate (SDS - PAGE): The silk fibroin molecule consisted of subunits a, b and c with molecular weights of 280 kD, 230 kD and 25 kD respectively, of which the b subunit was composed of two subunits e and f with molecular weights of 130 kD and 125 kD, respec-tively, connected by disulfide bonds. The conformation of silk fibroin and subunits was determinated by Raman spectroscopy and Large angle X - ray diffraction) LAXS. The native silk fibroin only contained a - helix and random coil, but there were three conformation such as random - coil.a - helix and β - sheet in the silk fibroin dissolved in KSCN solution and frozen at - 20 °C. This suggested that KSCN solution and - 20°C freezing action could lead to the conformational transi-tion from random - coil and a - helix to P - sheet. The a subunit mainly existed in β - sheet conformation, in con-trast, the c subunit was chie     

异亮氨酸拉链结构对可溶性CD40L生物学活性的影响

CD40配基(CD40L)为TNF超家族中的一员，瞬时表达于激活的CD4^ 的T淋巴细胞上．自然状态下膜上三聚体的CD40L通过和CD40受体(CD40R)结合，在免疫监视和肿瘤免疫中发挥作用．以PCR方法从peDNA3-CD40L质粒上扩增得到编码CD40L基因的胞外部分sCD40L，并将该片段插入大肠杆菌表达质粒pET30a上，构建得到大肠杆菌表达质粒pET30a-sCD40L；同时，在sCD40L的N端融合了异亮氨酸拉链(Isoleucine Zipper，IZ)结构，构建得到表达质粒pET30a-IZ-sCD40L．表达质粒在大肠杆菌中表达，得到可溶性的重组人CD40L和IZ-CD40L．SDS-PAGE分析结果表明重组人rhsCD40L和IZ-rhsCD40L在相应分子质量位置都有明显的条带产生，并得到Western blotting的确认．非SDS-PAGE电泳结果显示，异亮氨酸拉链结构有利于rhsCD40L蛋白形成聚合体结构．B细胞增殖实验和人骨髓瘤细胞株XG2凋亡实验结果都表明，异亮氨酸拉链结构提高了rhsCD40L的生物学活性．     

扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D（260）／D（280）值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带。根据扩展青霉所产碱性脂肪酶（Lip PE)N末端20个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3‘端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT－PCR技术和3‘－RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3‘非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用Clot Tech公司的SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS－PAGE检测结果表明,所表达的GST－Lip EP融合蛋白分子质量约为53ku;免疫印迹（Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC20718脂肪酶的基因。     

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．