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1.
The DNA fragment corresponding to the tissue plasminogen activator (tPA) sequence 174-262 (Kringle-2 domain) has been synthesized by using the solid phase phosphotriester method. The Kringle-2 domain of human tPA was expressed in Escherichia colt by secretion into the periplasmic space using the Lpp-Lac promoter and PIN-Ⅲ OmpA2 signal sequence. About two thirds of the expression product was secreted into the periplasmic space , and purified with ammonium sulfate fractionation, affinity chro-matography on Lysine-Sepharose, and FPLC-Mono Q exchange chromatography. The amino acid composition observed from the Kringle-2 purified from E. coli is identical with that expected for the 174-262 fragment of human tPA. Radio binding assay shows that the recombinant Kringle-2 domain possesses the activity of fibrin binding.  相似文献   
2.
人组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)。DNA重组在表达质粒pDR720中,在E.coliC600中获得了表达,表达水平为2%.以醋酸钟显色PAGE凝胶回收t—PA表达条带,进行复性处理.R性产物经Benzamidine—Sepharose4B,Lysine—Sepharose4B亲和层析,纯化得到SDS—PAGE银染一条带纯度,比活为为4,000mol/s·g的人t—PA.  相似文献   
3.
用PCR方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ^32的编码基因rpoH,并将基克隆至含有Ptac启动子的表达载体PUHE中。  相似文献   
4.
重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究   总被引:5,自引:5,他引:0  
将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .进行了等电点及肽图等性质研究  相似文献   
5.
重组人尿激酶原药代动力学的研究   总被引:5,自引:1,他引:4  
第一部分 :采用交叉设计 ,自身比较 ,研究了猕猴静脉注射 0 .4 ,0 .8和 3.2mg·kg- 1 重组人尿激酶原 (rhprouk)或 1.2 8× 10 5IU·kg- 1 尿源性天然尿激酶 (un UK) (其中推注 15 %剂量 ,90min内恒速滴注 85 %剂量 )后血浆中单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu PA)和双链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (tcu PA)的浓度随时间变化、代谢转化和各自的药代动力学 ,及代谢转化和药代动力学参数与剂量浓度的依赖关系 .结果表明给药后scu PA转化为tcu PA的速度与scu PA的剂量呈正相关性 .第二部分 :通过测定兔静脉推注加滴注1 2 5I rhprouk 0 .8mg·kg- 1 (其中 15 %剂量静脉推注 ,85 %剂量在 90min内滴注 ,比放射活性 2 .5 0 6MBq/mg)后不同时间体内各组织总放射性、TCA酸沉放射性 ,以及酸沉和总放射性的比值 ;胆汁引流物放射性累计排出量 ,尿和粪中累计排出量 ,及在体内外1 2 5I rhprouk与血浆蛋白的结合 .研究rhprouk在体内的分布、代谢及排泄情况 .结果表明rhprouk不与血浆中蛋白结合 ,代谢部位主要集中在胆、肾等部位 ,代谢产物主要随小便排出 .  相似文献   
6.
尿激酶原催化纤溶酶原的激活包括3个反应:(1)尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原转化为纤溶酶;(2)纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶;(3)尿激酶激活纤溶酶原,所以一直以来人们对尿激酶原激活纤溶酶原的过程知之甚少.研究发现EACA可以抑制尿激酶原催化的纤溶酶原激活。通过EACA对上述3个反应的影响进行逐个分析,观察到在EACA浓度为2.0mmol/L时,尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原激活的反应速度提高了4.5倍,尿激酶激活纤溶酶原的反应速度提高了6倍.相反地,纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶的反直被抑制了50%,此反应决定了EACA对尿激酶原催化纤溶酶原激活反应的抑制作用.该结果提示尿激酶原催化纤溶酶原激活反应的限速步骤是纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶,缘于纤溶酶和尿激酶原的赖氨酸结合位点的相互作用.  相似文献   
7.
将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI—Sepharose亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究.  相似文献   
8.
犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.  相似文献   
9.
利用PCR技术获得人尿激酶原Kringle结构域基因,将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中,并进而插入plasminogen Kringle 5一段16肽片段构建了其变体,重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,其产物以包涵体形式存在.通过体外复性,得到可溶性的prourokinase Kringle及其变体.所得蛋白质经过动物肿瘤模型测活,确定变体蛋白具有抑制肿瘤生长作用.  相似文献   
10.
利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。  相似文献   
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