金黄色葡萄球菌候选特征肽的靶向分析

采用液相色谱-串联质谱联用的靶向分析技术,通过检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌水解生成的特征肽,实现食品中致病菌的高效检测。针对文献报道的金黄色葡萄球菌的9种候选特征肽,验证了这些特征肽的靶向分析方法,考察和比较了分析效能。结果表明,基于多反应监测模式的靶向分析方法灵敏度高,更适于特征肽的检测;确定了每个特征肽最佳的碎片离子质量,进一步的生物样品分析结果表明,I1(AYLAVPAAPK)、I2(DYNSPTLIGWVK)、I5(AGYTVNNTPK)和I6(SISSGYTSGR)更适合作为金黄色葡萄球菌的候选特征肽。本研究为大规模验证候选特征肽的鉴定效果奠定了基础,为特征肽检测策略在食源性致病菌检测中的应用提供了参考。     

萘和苯酚降解菌中儿茶酚2，3-双加氧酶基因的类似性分析及杂种酶构建

从7个萘降解菌株和5个苯酚降解菌株中经PcR扩增得到12个儿茶酚2,3-双加氧酶(C23O)基因,大小均为924 bp.根据DNA序列的类似性,可将这12个C23O基因聚类为3组,此结果与分离菌株的样本来源基本一致.这12个基因均编码307个氨基酸残基的儿茶酚2,3-双加氧酶,序列中都含有9个严格保守的氨基酸残基(Gly30、His153、Leu172、His199、His214、His246、Tyr255、Pro259、Glu265),均属于外切双加氧酶的I.2.A亚家族.通过盒式PCR,用各种萘和苯酚降解菌的C23O基因中心区替换恶臭假单胞菌ND6菌株pND6-1质粒中nahH基因的中心区,得到5个杂种C23O基因,这些基因在pET-E.coli BL21(DE3)系统中表达以后,均能检测到C23O活性,其中中心区来自假单胞菌ND24菌株C23O基因的杂种酶C23O-ND24,其比活力高于对照恶臭假单胞菌ND6菌株的野生型C23O.     

假单胞菌ND6菌株水杨酸羟化酶基因(nahG)的核苷酸序列分析和酶鉴定

水杨酸羟化酶是细菌萘降解途径中的关键酶，它能催化水杨酸脱羟和羟化，生成儿茶酚．假单胞菌(Pseudomonas)DN6菌株的萘降解基因位于102kb的质粒pND6-1上，以pUC18质粒为载体，制备了含有1～3kb pND6-1 DNA随机片段的基因库，通过DNA测序和DNA序列同源性分析，从基因库中筛选出含有水杨酸羟化酶基因nahG的克隆．nahG基因的大小为1305bp，编码的水杨酸羟化酶(NahG)由434个氨基酸组成，与Pseudomonas putida NCIB 9816-4菌株的水杨酸羟化酶基因相比，核苷酸序列的同源性为100％，与其它10种细菌的水杨酸羟化酶基因相比，核苷酸序列的同源性为32％～99％．酶学实验表明，ND6菌株的水杨酸羟化酶具有广泛的底物特异性，它不仅能代谢水杨酸，还能代谢多种水杨酸的衍生物，如乙酰水杨酸、黄基水杨酸、3-甲基水杨酸、5-甲基水杨酸和5-氯水杨酸等．