酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子(36—76)的合成

本文报告用T_4RNA连接酶将相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))3′-半分子(36—76)的三个寡核昔酸大片段——10(36—45)(Ⅰ),12(46—57)(Ⅱ)和19p(58—76)(Ⅲ)——从3′-端向5′-端延伸逐个连接合成了这个tRNA的3′-半分子(36—76)。首先在供受体配比为1:1.5的情况下,采取三步连续反应,即19p(Ⅲ)的5′-磷酸化,然后与12(Ⅱ)的连接和连接反应产物的5′-磷酸化等反应,一次制备分离的方法,以70％的总得率合成了5′-磷酸化的三十一核苷酸(46—76)(Ⅳ)。然后,以(Ⅳ)作为下一步反应的供体和三倍量的10(Ⅰ)连接,以67％的产率合成了具有四十一核苷酸的tRNA_y~(Ala)的3′-半分子(36—76)(Ⅴ)。将这个合成的3′-半分子,5′-磷酸化以后,与天然的5′-半分子连接,人工半合成了tRNA_y~(Ala)整分子,经生物活力测定,这个人工半合成的tRNA_y~(Ala)具有接受[~3H]-丙氨酸、并能将接受的丙氨酸转移到蛋白质分子中去的生物活力。     

固相T4-RNA连接酶

T4-RNA连接酶自1972年由Silber等人发现以来,已有不少的研究结果说明,T4-RNA连接酶在没有模板的情况下,能有效地催化RNA5′-端磷酸与3′-端羟基形成分子内或分子间的磷酸二酯键。它亦催化DNA之间,或RNA与DNA之间的连接反应。在酶的分离纯化方面,亦相继进行了不少的研究工作,并有了改进,可以比较容易地获得较大量的一定纯度的制品,给研究工作提供方便与可能。它是一种有用的工具酶被用来合成具有确定顺序的多核苷酸     

导向溶栓分子scFv-UK32中连接肽的引入和在昆虫细胞中的表达

为了提高重组导向溶栓分子scFv-UK32的溶纤活性,通过重组PCR方法在编码scFv与UK32的碱基之间引入编码KLGGGG连接肽的碱基序列,并克隆到转移载体pBacPAK9上,通过与线性病毒DNA BacPAK6/Bsu36I digest共转染到昆虫细胞Sf 9内,进行表达.表达产物分泌到上清中,共转染后第5d(天)用纤维平板法测得Sf 9细胞上清溶纤活性达到107 IU/mL,比未引入连接肽的scFv-UK32的表达活性(25 IU/mL)高.ELISA实验表明共转染上清具有明显对活化血小板特异结合能力.Western Blotting实验表明共转染上清可与Pro-UK的单抗特异结合.     

电离辐射对鸡胚的距离效应

孵化40小时鸡胚以铅块遮盖,蛋清接受20250仑X线照射,能够对鸡胚发育产生有害的距离效应,孵化期间胚胎大量死亡,孵化率下降至20％左右,若在孵化前照射蛋清,孵化后对鸡胚亦产生致命性影响,当然,损伤的程度较之孵化后照射略轻,蛋清受照射的早期胚胎的卵黄囊血管区发育不良,血管细弱,血液颜色暗淡,死亡个体多伴有血管破裂、出血和溶血,胚胎出现迟育现象,表现为体形弱小,体节分化受到抑制,并伴随以S~(35)-蛋氨酸掺入为指标的胚胎代谢强度的下降,这些现象,与射线直接照射鸡胚的损伤效应有 许多基本相同之处,交换蛋清的实验证明,X线对鸡胚发育的距离效应,主要是通过受照射蛋清系统这一中间环节而实现的。     

导向溶栓分子scFv-UK32中连接肽的引入和在昆虫细胞中的表达

为了提高重组导向溶栓分子scFv-UK32的溶纤活性,通过重组PCR方法在编码scFv与UK32的碱基之间引入编码KLGGGG连接肽的碱基序列,并克隆到转移载体pBacPAK9上,通过与线性病毒DNA BacPAK6/Bsu36I digest共转染到昆虫细胞Sf 9内,进行表达。表达产物分泌到上清中,共转染后第5d(天)用纤维平板法测得Sf 9细胞上清溶纤活性达到107 IU/mL,比未引入连接肽的scFv-UK32的表达活性(25 IU/mL)高。ELISA实验表明共转染上清具有明显对活化血小板特异结合能力。Western Blotting实验表明共转染上清可与Pro-UK的单抗特异结合。     

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高效表达人尿激酶原cDNA基因

将人尿激酶原(pro-UK)cDNA分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体pBK283和pBF4中,构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒DNA(BmNPV genomic DNA)共转染家蚕培养细胞,经病毒斑实验(Plaque assay)筛选出含pro-UK cDNA的稳定重组病毒株BmNPV-pk1和BmNPV-pk2。将此两株重组病毒分别感染家蚕培养细胞和家蚕幼虫4天后,用酶联免疫测定法(ELISA),纤维蛋白平板溶圈测活法和Western印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织,证实均有pro-UK表达。家蚕培养细胞的表达量分别为0.0012mg/mL(上清液和10~6细胞)和0.0031mg/mL(上清液和10~6细胞),家蚕幼虫体液的表达量分别为0.0100mg/mL和0.0300mg/mL。从以上结果可看出,家蚕幼虫体液的表达量是培养细胞的10倍,以上表达产物在纤维蛋白平板上测活均有溶纤活性。     

兰色葡聚糖琼脂糖亲和层析法纯化T_4 RNA连接酶

T_4RNA连接酶首先由Silber等人在T_4噬菌体感染的E.Coli中发现和初步提纯的。当ATP存在时,它能够催化一定链长的单链寡聚核苷酸5′一端磷酸单酯与3′一端羟基之间形成分子内或分子间的3′,5′磷酸二酯键。RNA连接酶能催化3′,5′二磷酸核苷与寡核苷酸受体相连接。此反应可用于一定序列寡核苷酸的合成,和核苷酸3′一端的同位     

β－actin启动子控制的人尿激酶原基因在CHO细胞中的表达

本文将人尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）ｃＤＮＡ基因插入到含β－肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）启动子的表达载体中，通过脂质体转化到中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞内，经筛选得到稳定表达ｐｒｏ－ＵＫ基因的细胞株，用ＥＬＩＳＡ检测到细胞培养液中表达量为２～３ｍｇ／Ｌ。经过抗尿激酶（ＵＫ）的免疫亲和柱初步纯化细胞培养上清后得到表达产物。同时，在培养液中加入佛波酯ＰＭＡ后，发现它对目的基因的表达有促进作用。     

重组PAI-1在大肠杆菌中表达条件的研究及其对t-PA，u-PA抑制的分析

带有表达质粒pBV220/PAI-1的大肠杆菌中,在菌体密度为Ａ_600nm=0.3--0.4时诱导,表达重组PAI-1(rPAI-1)的效率最高。在诱导后的6h以内,rPAI-1的百分含量持续升高。rPAI-1经分离纯化并用盐酸胍激活后,能够与t-PA及u-PA反应,用SDS-PAGE和纤维蛋白自显影方法可以检测出它们所形成的复合物。     

人胰岛素原类似物（B-Arg-Arg-A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（PCR）法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物（BArg-Arg-A）基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR₂A。再将pUC18BR₂A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。