腺病毒载体介导的GFP在鸡胚成纤维细胞中的表达及RNA干涉

鸡胚成纤维细胞（CEF）是多种动物及人类病毒的易感细胞;也是研究鸡的基因组功能的理想材料．本试验的目的是研究非复制型腺病毒载体对CEF的转染效率及安全性;并建立在CEF细胞中进行RNAi的技术平台．采用GFP重组非复制型腺病毒载体（Ade-GFP）转染CEF细胞：结果证明0．1．2000 MOI Adv-GFP均可转染CEF细胞并表达GFP;转染后16h开始出现GFP阳性细胞：胞核与胞浆可见明亮的荧光：荧光细胞数量及荧光强度在24～36h达到高峰：以后逐渐衰减;约180h全部消失;转染效率最高为22.3％;形态学观察及流式细胞仪测定结果显示：Adv-GFP转染的CEF细胞未见细胞病变;多数转染组细胞活力不受影响：说明用Adv-GFP携带外源转染CEF细胞是安全可行的;用脂质体转染试剂转染化学合成的GFP-siRNA;成功地干涉了腺病毒载体介导的GFP基因在鸡胚成纤维细胞的表达：干涉效率为85％：证明了鸡胚成纤维细胞中存在RNAi机制：为进一步利用非复制型腺病毒载体递送siRNA在CEF细胞内进行RNAi的研究奠定了基础．     

RNAiFect~(TM)和SuperFect转染试剂对4种细胞活性的影响

在RNA干涉中,转染试剂的用量与siRNAs的量成正相关关系,但因转染试剂对细胞有一定的毒性作用,超过一定用量可以引起细胞形状改变、脱落、甚至死亡,直接影响着干涉的效率,所以确定转染试剂的优化用量,是RNA干涉试验中的重要环节.将不同用量的RNA iFectTM和SuperFect两种转染试剂分别加入鸡胚成纤维(CEF)细胞、293细胞、PK细胞和MDCK细胞中,在4h和24h后观察细胞的活力情况,比较了不同转染试剂对不同细胞的影响.结果表明:相同用量的两种转染试剂对293细胞、PK细胞和MDCK细胞的生长的影响远远小于对CEF细胞的影响;两种转染试剂用于外源小分子转染时,建议在293细胞、PK细胞和MDCK细胞上的用量不超过3u l;两种转染试剂对CEF细胞的毒性较大,不适合用于转染.     

荧光定量PCR技术及其在动物病毒病定量检测中的应用

荧光定量PCR技术是一种核酸定量技术,该技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.该技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,因此在动物病毒病的检测中,荧光定量PCR技术不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体内的分布,还具有灵敏、快速、省力的特点.