海藻酸微球的制备及结构与性能间相互关系

采用高压静电液滴法制备海藻酸钙微球(AGS)。首先通过改进高压装置中电场环境,形成均匀电场,制备单分散AGS;在此基础上,以牛血清白蛋白、血红蛋白为药物模型,系统地研究载药微球的表面形貌、内部结构、溶胀比以及载药释药性能。实验结果表明:在电场中加入直径为17cm的圆形铁环,可有效减少子液滴的形成,制得粒径为(219±6)μm的单分散AGS;另外,海藻酸钠包载不同的药物将形成不同的AGS内部结构,进而影响AGS强度及载药释药性能。释放液中牛血清白蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,该制备方法并未对被包埋蛋白的相对分子质量产生影响,为AGS在蛋白类药物缓控释载体领域中的应用奠定了基础。     

高分子纳米材料与血浆蛋白的相互作用

由于纳米材料具有独特的物理和化学性能,使其在许多领域被广泛应用。纳米材料使用的日益增多要求我们仔细评估其难以预料的毒性（细胞毒性、溶血毒性、血液毒性和免疫毒性）和生物学相互作用。到目前为止,已有大量的研究旨在探索纳米材料与人的细胞或蛋白之间的相互作用,也取得了一些重要成果。在临床应用中,有些生物医用纳米材料常通过静脉注射、渗透、溶解和扩散等方式引入到血液组织中。血液是一种高度复杂的组织,主要由红细胞、白细胞、血小板和血浆组成。其中血浆是一个复杂的体液,它包含超过3700种不同的蛋白质。无论采用哪种方式,这些纳米材料将不可避免地会与丰富的血浆蛋白（或其他血液成分）发生某种联系和相互作用。然而,纳米材料和血浆蛋白之间的相互作用,可能在决定纳米材料的毒性方面起到至关重要的作用。目前对纳米材料与血浆蛋白（或其他血液成分）在分子水平会发生怎样的相互作用知之甚少。本文主要综述了典型的三类高分子纳米材料（包括聚阳离子,高分子胶束和药物（基因）/载体复合纳米粒子）与血浆蛋白的相互作用以及研究这些相互作用相关的分析技术的研究进展,这些内容对体内使用的纳米材料的分子设计和血液安全性非常重要。     

基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立

目的 构建基于Cre- LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法 首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、 Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果 成功构建了基于Cre- LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL /6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg (EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论 成功建立运用Cre- LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。     

一套有效的产业机构内部培训规程的制订和实行

在审核实验方案期间 ,我们注意到原来进行体外实验研究的工作人员自身发现需要进行动物体内研究 ,这部分研究人员在不断增加。为了更好地适应对动物操作和技术培训需求的增加 ,我们创办了动物操作和基本技术的研修班。这并不是我们当前一对一的培训计划。我们的目标是新受雇者、暑期实习医生以及被要求转为体内实验的研究人员。研修班集中进行动物操作和基本技能培训。参加者有一份课程提纲和研修班中所授各种方法的详细指导手册作为参考 ,而后进行评估并在其培训档案中提供证书。研修班开始几个月后 ,我们开始注意到了参加培训人员的转变。…     

p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器质量及血液学参数测定

摘要: 目的测定自主建立的p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,并比较周龄、性别对各项指标的影响。方法选取4 周龄和8 周龄的p53+ /－ 基因敲除小鼠各20 只,雌雄各半,测定其主要脏器质量及血液生理指标。结果不同周龄和性别的p53+ /－ 基因敲除小鼠部分脏器质量和血生理生化有差异性。4 周龄和8 周龄小鼠在体质量等这21 项指标上都有差异显著性( P ＜ 0. 01) ,且在左肾上腺等8 项指标上差异存在统计学意义( P ＜ 0. 05) 。4 周龄的雌、雄小鼠在ＲDW、总胆固醇( CHO) 这2 项指标上差异存在显著性( P ＜ 0. 01) ,仅肺这1 项指标上差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) ,其余指标之间无明显差异; 而8 周龄雌雄小鼠在体质量等16 项指标上雌雄间都有显著性差异( P ＜ 0. 01) ,在HCT 等9 项指标上存在差异( P ＜ 0. 05) 。结论本文测定并比较了不同周龄及性别的p53+ /－ 基因敲除小鼠的脏器及血液生理生化指标,为该模型的合理利用及商业化供应提供了背景数据。     

Rag2 敲除大鼠剖腹净化

摘要: 目的 利用剖腹产的方法对基因工程 Rag2 敲除大鼠进行净化。方法 分别对见栓第 20 天和第 22 天的孕鼠 进行剖腹产手术,剖得仔鼠于 6—8 日龄时进行剪尾作 PCR 基因型鉴定,6—8 周龄进行微生物检测和基因型鉴定。 结果 大鼠剖腹产于见栓第 22 天进行,可以显著提高成活率,平均离乳率 84. 48% ; 净化后经检测,微生物等级符 合 SPF 级标准; 经基因型鉴定,可获得纯合子大鼠。结论 Rag2 敲除大鼠通过剖腹产净化可获得 SPF 级纯合子后 代,证明该方法可行。     

遗传工程小鼠冻存卵巢异体原位移植比较研究

目的 对 C57BL / 6 J 为背景的遗传工程小鼠卵巢冷冻及复苏后原位移植进行研究,建立遗传工程小鼠卵巢 冷冻方法,弥补小鼠资源保种体系。 方法 采用 DAP213 方法冷冻保存了 C57BL / 6 J 及 SCARB2、PSGL1、IGB3S 三 个遗传工程小鼠 10 日龄幼鼠的卵巢,将四个品系 10 日龄幼鼠的新鲜卵巢及冻存复苏卵巢原位移植到 4 周龄 C57BL / 6 J 及 C57BL / 6 J( Cg) —Tyrc- 2 J / J( B6 albino)受体雌鼠,术后饲养 5 周与 10 周龄性成熟 C57BL / 6 J 雄鼠交 配,观察移植出生幼仔。 结果 C57BL / 6 J 新鲜卵巢和冻存卵巢,三个品系遗传工程小鼠的冻存卵巢原位移植到 C57BL / 6 J 和 B6 albino 受体中,均可以恢复正常功能,交配后得到仔鼠。 结论 采用 DAP213 方法冻存 C57BL / 6 J 及以 C57BL / 6 J 为背景的遗传工程小鼠卵巢,复苏后原位移植到 C57BL / 6 J 和 B6 albino,交配后产仔,卵巢冻存方 式是小鼠资源库保存的一个重要补充。     

海藻酸-羧甲基壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶的制备及对蛋白药物释放的探讨

以牛血清白蛋白(BSA)为模型药物,制备了海藻酸-羧甲基壳聚糖(CMCS)/聚乙烯醇(PVA)复合水凝胶,考察了海藻酸水凝胶微球的粒径和微球在水凝胶基质中的分散性,分析了复合水凝胶基质的结构、溶解分数以及水凝胶在不同pH值下的溶胀率和药物释放。结果表明,药物的累积释放率(CR)随pH值的升高而升高,当pH值为1.2时CR为32%,当pH值为6.8时CR为53%,当pH值为8.0时CR达到70%,表明该复合水凝胶的释药性能受pH值的影响较大。     

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。     

应用24个微卫星标记分析SD和Wistar大鼠的遗传多样性

目的 通过SD和Wistar大鼠群体遗传多样性分析,为其质量控制提供基础数据。方法 采用微卫星DNA标记技术,选取分布于21条染色体上的24个微卫星位点分别对12对SD大鼠和Wistar大鼠的DNA样本进行PCR扩增,所得扩增产物经二代测序分型,再利用PopGen32软件、Littleprogram0.6和GenePop分别进行等位基因、平均杂合度、多态信息含量及遗传平衡检验参数的计算。结果 SD和Wistar大鼠群体分别在24个微卫星位点检测到平均等位基因数3、2.95个,平均杂合度为0.434 4、0.426 1,平均多态信息含量分别为0.38、0.37,分别有10、9个位点偏离了Hardy-Weinberg遗传平衡,其中7、4个位点表现为杂合子缺失。结论 SD和Wistar大鼠封闭群遗传多样性略低于理想封闭群水平,需要在种群繁育中注重科学管理监测,避免近交。