Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化

来源于Pyrococcus furiosus COM1菌的Pfu DNA聚合酶具有保真性高、延伸速度快、热稳定性强等特点,能够提高PCR反应过程中的扩增效率,减少错误碱基掺入率.以大肠杆菌Rosetta(DE3)为重组细胞,利用一种快速表达纯化方法,让Pfu DNA聚合酶的表达纯化过程变得更加简便,并维持其高活性.结果表明,Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中能够进行大量表达,同时60℃高温水浴能有效去除杂蛋白,简化纯化步骤及提高Pfu DNA聚合酶纯度.经过一系列纯化步骤处理后,Pfu DNA聚合酶仍然能够保持较好的酶活,且在100μL PCR反应体系中,加入4μL的1 mg/mL Pfu DNA聚合酶液效果最佳.     

一种甲基膦酸酯降解菌的筛选、鉴定以及特性分析

甲基膦酸酯是一种结构最简单的膦酸酯,常作为研究有机磷基础地球化学过程的代表性物质,其降解过程是全球磷循环中复杂有机磷降解、末端释放正磷酸盐的关键步骤之一.本研究拟针对甲基膦酸酯的微生物降解,筛选具有较好降解作用且能有效释放正磷酸盐的微生物菌株,并开展其降解和释放特性分析,为进一步解析有机磷的生物分解机制提供基础数据.采集有机磷农药施用的土壤,进行富集培养,使用含有5 mmol/L甲基膦酸酯的无机盐固体平板分离得到了一株可以降解甲基膦酸酯的细菌.其16S rRNA基因克隆鉴定为伯克氏菌属(Burkholderia),将其命名为Burkholderia strain HQL1813.单因素实验研究表明该菌株生长的最适温度为28℃,最适pH为7.在最适条件下,菌株降解甲基膦酸酯同时释放产生正磷酸盐,培养基中释放磷酸盐最大浓度为90～228μmol/L.实验表明该菌能够降解甲基膦酸酯,对环境科学中磷循环的研究、有机磷降解机制的探究以及有机磷降解的应用有重要意义.     

人鼻病毒3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

人鼻病毒3C蛋白酶具有高特异性,且在低温条件下具有较高酶活,目前已被商品化.在大肠杆菌中利用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签可促进人鼻病毒3C蛋白酶的可溶性表达.将人鼻病毒3C蛋白酶的DNA编码序列克隆到pRK792载体上,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,获得MBP-LEVLFQGP-6x His-人鼻病毒3C蛋白酶融合蛋白,随后通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白.用该产物切割纯化的MBP-LEVLFQGP-6x His-木聚糖酶融合蛋白,可获得木聚糖酶并用底物平板检测其活性.实验结果表明人鼻病毒3C蛋白酶能够在大肠杆菌中表达,并且能特异性地在其底物识别序列进行切割,从而移除MBP标签,获得仅带有6x His的人鼻病毒3C蛋白酶.该酶可以特异性地去除木聚糖酶融合蛋白中的MBP标签,获得有活性的木聚糖酶.利用MBP标签能够促进人鼻病毒3C蛋白酶可溶性表达,且人鼻病毒3C蛋白酶的活性不受影响,有利于一些不稳定的蛋白在低温下的标签去除和纯化.