人miR-34a靶基因的生物信息学分析及载体构建

目的对人miR-34a(hsa-miR-34a)下游靶基因进行预测,并构建含自噬相关基因靶结合序列的GFP报告基因载体。方法使用TargetScan Release 5.1和RNA22软件分析hsa-miR-34a可能的靶基因,并利用Gominer软件对靶基因功能进行分析。根据预测结果,合成含自噬相关基因hsa-miR-34a靶序列的寡核苷酸,以pEGFPC2为载体构建系列质粒,并检测各载体的真核表达情况。结果预测结果显示hsa-miR-34a共有2904个下游靶基因,功能涵盖生物过程、细胞组分、分子功能三大类,其中与自噬作用直接相关的靶基因有beclin 1和sestrin 2。构建含beclin 1和sestrin 2作用位点的GFP载体共5个,质粒转染Hela细胞后在荧光显微镜下可见绿色荧光。结论成功构建hsa-miR-34a下游自噬相关基因靶位点序列GFP报告基因载体,为进一步研究hsa-miR-34a对自噬的调控作用奠定基础。     

Seldi-Tof-MS技术检测大鼠抗Thy-1模型的血清差异多肽

目的利用生物大分子表面加强的激光解析/电离时间飞行质谱技术(Seldi-Tof-MS)检测大鼠抗Thy-1模型在系膜增殖期血清中的差异多肽,寻找与系膜增殖相关的生物标志物。方法12只200g雄性Wistar大鼠,分为对照组和模型组,对照组尾静脉注射0.9%氯化钠注射液,模型组尾静脉注射抗Thy-1抗体,7d后处死。过碘酸-希夫(PAS)染色检测病理变化,Seldi-Tof-MS检测血清中差异多肽。结果模型组在第7天出现明显的系膜细胞增殖和基质积聚,与对照组相比,模型组有两个多态峰发生变化(P<0.01),其中质荷比为2746ku的多肽在模型组高表达,7399ku在模型组低表达。结论利用Seldi-Tof-MS在抗Thy-1模型血清中成功发现了两个差异多肽,他们可能是系膜增殖相关生物标志物。     

原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证

目的探索并验证原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件。方法设立不同的电压与电容组合、电击前孵育温度、质粒DNA浓度等电转染条件,将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1导入原代大鼠肾小球系膜细胞。24h后比较各组细胞存活率和绿色荧光蛋白表达情况,确立最佳电转染条件。再以此条件电转染质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-FHL2,48h后收取两组细胞RNA和蛋白。应用RT-PCR和Western印迹检测目的基因FHL2的核酸和蛋白表达,验证电转染效果。结果在电击前室温孵育,40μg质粒,340V电压、550μF电容的最佳电转染条件下,原代大鼠肾小球系膜细胞的电转染效率可达40%以上,细胞存活率在50%左右。转染FHL2质粒组较对照组检测FHL2的核酸和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论适当的电转染条件可以有效转染原代大鼠肾小球系膜细胞。