二抗物种特异性对双色STORM成像的影响（特邀）

随机光学重建显微术（STORM）基于免疫荧光标记技术,具有原理易懂、光路简单、分辨率极高等特点,一直受到科研工作者的青睐,但分辨率的提升对抗体的特异性提出了更高的要求。相较一抗直接标记,“一抗+二抗”的间接标记法在实际应用中普适性更强。二抗相对一抗存在物种特异性的问题,生产时需要对其进行预吸附来提升物种特异性。为了探究二抗物种特异性对双色STORM成像的影响,基于经典的红细胞骨架模型中血影蛋白N端和C端的互斥位置关系,对二者使用高、低吸附二抗标记后分别进行双色STORM成像,对照模拟中有无信号串扰条件下的互相关分析结果,结果表明低吸附二抗会造成二者共定位的假象。进一步,分别通过高、低吸附二抗对MDA-MB-231乳腺癌细胞CD47和PD-L1两种膜蛋白进行双色STORM成像,结果揭示两种蛋白无共定位关系。本研究为二抗物种特异性的评估提供了一种基于红细胞骨架结构模型的超分辨成像新策略,助力双色STORM成像精准阐明蛋白分子互作关系。     

核孔复合物单分子定位超分辨图像的筛选和重构

核孔复合物（NPC）是细胞核膜上由多种蛋白组装而成的复杂结构,在细胞核质交换和信息传递中起着关键作用。单分子定位超分辨成像（SMLM）以其特异性和高成像分辨率成为研究NPC超微结构的主要方法之一。然而,由于抗体标记不完全等因素导致的数据丢失,给后续分析带来了困难。笔者使用SMLM提供的定位信息,结合基于密度的空间聚类算法（DBSCAN）和层次聚类算法进行数据的提取和分类,建立了NPC筛选和定位的分析流程,并采用该处理流程得到了缺失较少且形貌比较均匀的核孔。进一步,基于最小二乘法原理对筛选得到的大量NPC进行质心对齐的重构处理,成功复现出了其经典的八重对称结构,并揭示了核孔蛋白Nup133与Nup98的精确相对位置关系。本研究通过建立核孔筛选和重构的标准流程,填补了SMLM数据的缺失。采用该流程对多种核孔蛋白进行分析,揭示它们的结构特性。所建流程为理解核孔的复杂结构提供了一种高通量的定量分析方法。     

结合多次DBSCAN和层次聚类算法的膜蛋白单分子定位超分辨图像分割

膜蛋白在细胞膜上的时空分布形式决定了其活性状态及功能，在调控细胞生命活动过程中起着重要作用。单分子定位超分辨成像（SMLM）技术为在纳米尺度解析膜蛋白的空间分布提供了可能，但分辨率的极大提升对图像准确聚类分割提出了更高要求。基于密度的空间聚类算法（DBSCAN）是常用的聚类方法之一，但其对于膜蛋白分布不均匀的SMLM超分辨图像的分割效果往往不太理想。本文提出了一种结合多次DBSCAN和层次聚类的混合聚类算法，该算法以DBSCAN方法为分割基础，通过进一步的面积阈值分析和层次聚类，在保持超分辨点簇图像精确聚类识别的前提下，仍能保留每个点簇内的多次定位信号。将该算法应用于模拟数据集和实验数据分割得到的轮廓系数等性能普遍优于传统DBSCAN算法。这种混合聚类方法为膜蛋白SMLM超分辨图像的聚类分割提供了新思路和新方法，有助于更精准地分析膜蛋白在纳米尺度上的空间分布信息。     

人红细胞膜骨架超分辨图像的Vorono?分析

成熟人红细胞膜骨架是由膜下多种蛋白组成的三角晶格网状结构，在维持红细胞形态、变形性、运动和代谢等功能方面扮演着重要角色。单分子定位超分辨成像(SMLM)技术在解析骨架超微结构方面展现出了强大的能力，但分辨率的提升对成像分析手段提出了更高要求。作为一种常用的空间分析方法，Vorono?分割在SMLM图像聚类分析中已被广泛应用。笔者利用自主搭建的SMLM超分辨成像系统获得红细胞膜蛋白和骨架蛋白的超分辨点簇图像，对点簇质心进行Vorono?分割，并对Vorono?多边形面积分布进行伽马函数拟合，发现自由膜蛋白CD59的伽马分布峰值对应的x轴坐标x_peak为0.78。结合模拟结果，验证了自由膜蛋白CD59呈随机分布。进一步，肌动蛋白、血影蛋白N端和原肌球蛋白的Vorono?分析结果显示它们的x_peak均为0.86，而锚蛋白的x_peak为0.84，说明骨架膜蛋白呈相对均匀的分布状态，但锚蛋白较其他骨架蛋白更具随机性。Vorono?方法可助力阐释红细胞膜骨架蛋白的空间分布特性，同时也为点簇状SMLM超分辨图像数据的深入提取提供了新思...