光谱及分子探针方法研究番茄Metacaspase蛋白与Ca~(2+)的相互作用

Metacaspases(MCPs)是发现于植物、真菌、原生动物体内的一种结构上类似多细胞动物Caspase的半胱氨酸蛋白酶家族,其大多数成员的激活依赖于钙离子,但钙离子如何影响MCPs的激活机制有待深入研究。借助圆二色谱技术、Terbium/Stains-all探针技术以及荧光光谱技术,以番茄Ⅱ型Metacaspase(LeMCA1)重要位点突变的三种体外原核表达重组蛋白,包括LeMCA1C139A(活性催化位点突变体)、LeMCA1K223G(自降解位点突变体)以及预测的Ca2+结合位点突变体LeMCA1D116A/D117A为研究材料,探究了MCPs与Ca2+相互作用机制。实验结果表明,Ca2+与LeMCA1之间既不存在强烈的结合作用,也不影响蛋白的二级结构,但Ca2+通过相互作用改变LeMCA1的三级结构来实现对LeMCA1的酶原激活过程。其中,LeMCA1蛋白的Asp-116,Asp-117氨基酸残基作为预测的与Ca2+作用的重要位点,其缺失将导致蛋白与Ca2+相互作用能力下降。利用圆二色谱、荧光光谱结合离子探针技术研究了典型茄科植物番茄中Ca2+与LeMCA1的相互作用特性,结合之前同源序列比对、位点突变结果确定了LeMCA1中的Asp-116,Asp-117氨基酸残基影响着Ca2+与蛋白质的相互作用。该结果对后续LeMCA1的生化特性及晶体结构的解析研究有着重要的参考价值。