肌酸激酶变性过程中圆二色光谱变化及巯基暴露的速度

本文以 CD光谱及巯基测定两种方法监测了肌酸激酶的变性过程.快速可反应巯基的测定表明,巯基暴露速度与从前报道过的荧光光谱及紫外差光谱的变化速度大体相当.但是,在低浓度胍溶液中,隐蔽的芳香氨基酸尚未暴露时,酶分子的椭圆度值已有了明显可察的变化.变性速度的比较表明,220nm平均残基椭圆度值的变化速度明显地慢于芳香氨基酸、巯基的暴露速度.这可能意味着,肌酸激酶分子内某些肽段具有松散的二级结构,又靠近分子表面,易受到低浓度胍的变性作用.而整个酶分子的二级有序结构的破坏,还是慢于卷曲肽链的伸展速度,也即三级结构的破坏速度。     

松香作捕集剂快速分光光度法测定海水和河水中的痕量铜(Ⅱ)

重金属元素在天然水中含量都很低,直接测定比较困难,往往需经预先富集和分离,常用的溶剂萃取法稳定性较差。因此,研究一种较为简便、快速的富集分离方法很有必要。我们成功地试验采用天然有机物松香,配合离子表面活性剂油酸钠等,在NaCl,NaNO_3或Na_2SO_4介质中,可富集Cu~(2+)、Cd~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、UO_2~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)、Au~(3+)、Cr~(3+)等离子。     

羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照产生新萤光物质的研究——生成条件与性质

本文报道兔肌和猪肌GAPDH经碘代乙酸修饰活性部位半胱氨酸巯基后,在有NAD~+存在下,经紫外光照射可以产生一萤光新峰,其发射波长为410nm,激发光谱为双峰形,峰值分别为293nm和325nm。形成新峰的最适光照波长为280—290 nm,说明新萤光物的形成与芳香族氨基酸的激发有关.在光照过程中,随410nm萤光的增强,由295nm紫外光激发的340 nm蛋白萤光则明显降低,这说明在色氨酸与新生成的萤光发色团之间有能量转移.生成萤光新峰的光化学反应具有高度特异性,用碘代乙酰胺和四硫硫酸钠代替碘代乙酸对Cys-149进行修饰不能产生新峰.在NAD⁺类似物中,ADPR,AMP,ATP和NADH不能生成新峰.而β-NMN⁺和NADP⁺在加大浓度的情况下,可代替NAD⁺与CM-GAPDH生成新的萤光斗句质.文中对新峰发色团与酶蛋白的关系也进行了初步探讨。     

羧甲基D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照产生新荧光物质的研究——十二烷基硫酸钠的影响

对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶,无论是酶朊、羧甲基化酶朊,或经光照产生新荧光物的光照酶,在加入十二烷基硫酸钠(SDS)并扫描差吸收光谱时,均产生295nm及288nm两个负峰以及267nm的正峰,同样SDS也引起酶朊和羰甲基化酶朊的蛋白荧光淬灭,这些无疑都是由于原来位于酶蛋白内部非极性环境的色氨酸及酪氨酸残基转移到分子外部极性环境所致。新荧光物的形成对SDS非常敏感,在光照前加入SDS使其与酶的重量比为0.5时新峰的形成已经大为减弱,但与此同时其蛋白荧光却比上述对照样品为高,SDS对已经形成的荧光新峰的强度也有影响,但需要更多的SDS才能使新峰荧光强度有较明显的下降,在SDS与酶的比值约为0.5时,新峰荧光强度下降还不明显,但蛋白荧光强度却反而略有增加,这些结果表明,在酶分子内部的色氨酸侧链、NAD⁺以及活性部位巯基上的羰甲基之间的空间关系受到SDS破坏时,形成新荧光物的光化学反应就不能进行,在新荧光物形成之后,它与色氨酸之间的能量转移关系,也同样是对SDS敏感的。     

CHANGES IN CIRCULAR DICHROISM AND EXPOSURE OF BURIED THIOL GROUPS DURING DENATURATION OF RABBIT MUSCLE CREATINE KINASE

The denaturation of creatine kinase in guanidine solutions has been followed by both CD changes and the increase in rapid reacting SH groups. The rates of the exposure of SH groups axe in general agreement with the ultraviolet absorbance and fluorescence changes reported previously whereas changes in the ellipticity of the enzyme molecule can be detected at low guanidine concentrations before significant changes in the exposure of the aromatic residues could be observed. On the other hand, the rates of changes in the mean residue ellipticity at 220 nm are clearly slower than the changes in ultraviolet absorbance, fluorescence and exposure of SH groups. It is suggested that the secondaxy structure of the external regions of the peptide chains is affected at low guanidine concentrations followed by gross changes in the tertiary structure of the molecule resulting in the exposure of the buried aromatic residues. The destruction of ordered secondary structure of the peptide chain is a slower process than th     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性部位巯基与配体结合的关系

本文用荧光滴定、透析平衡和分子筛柱层析等方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称为GAPDH)与配体的结合进行了研究. 荧光滴定的实验结果,GAPDH酶肮与εNAD⁺结合为负协同性,如果酶的Cys-149巯基经碘代乙酸或四硫硫酸钠修饰后,则不仅酶与εNAD⁺结合减弱,并且其结合的负协同性也明显减弱.与此相应,εNAD⁺与酶蛋白结合后εA部分的荧光增强也不如未修饰酶那样明显.分子筛柱层析的结果指出,当酶的Cys-149巯基经化学修饰后,酶与ATP的结合能力也大大下降.这些结果都说明,酶活性部位Cys-149巯基不仅和酶与NAD⁺的菸酰胺部分的结合有关,它的修饰还直接影响到酶的腺嘌呤结合部位,从而影响到酶与配体结合的协同性质.荧光滴定和透析平衡的结果还表明,温度升高酶与εNAD⁺结合的负协同性增强,酶与ATP的结合则由非协同性变为负协同性.     

羧甲基D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照产生新荧光物质的研究——色氨酸与新荧光发色团之间的能量转移

羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶在光照过程中形成的新荧光发色团,在325nm处有一平缓的吸收峰,它的位置和蛋白荧光有相当部份是重叠的,并且随着410nm荧光新峰的增强,蛋白荧光逐渐下降,这一结果说明酶蛋白部份的色氨酸残基与新荧光发色团之间存在着非辐射性的能量转移,我们对这一能量转移进行了测定并根据Fster公式计算了供受体之间的距离.由于在四聚体酶分子中,很可能只生成两个新荧光发色团,方向因子K~2采用供受体均能自由转动的数值,即K²=2/3,据此计算,供体色氨酸与新荧光发色团之间的距离为15.76。     

醇脱氢酶和其它蛋白质光照产生新荧光物质的研究

前已报道羧甲基D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶在紫外光照射下生成发射峰为410毫微米的新荧光物.为了探讨这一现象是否具有普遍性,我们首先研究了酵母及马肝醇脱氢酶,发现醇脱氢酶在光照下也同样能生成荧光衍生物,但生成条件与荧光物性质都与甘油醛-3-磷酸脱氢酶不同.醇脱氢酶要求较强的光照,不需要活性部位巯基的羧甲基化也不需要NAD⁺的存在.所生成的荧光物的发射峰值为400毫微米.在光照过程中,醇脱氢酶迅速失活,同时320毫微米附近光吸收增加,半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及组氨酸则遭到部分破坏.对十余种蛋白质及多肽类物质进行紫外光照的结果,都能生成发射峰在395—400毫微米附近的荧光衍生物,说明紫外光照产生荧光物质是蛋白质的一种普遍性质.