线粒体荧光标记的单颗粒水平高通量评估方法

线粒体是真核细胞能量代谢和信号转导的调控中枢,虽然各种灵敏、特异的线粒体荧光标记技术已经被广泛应用于线粒体研究,但仍缺乏单线粒体水平的荧光染色性能评估方法。基于超高灵敏流式检测技术( High sensitivity flow cytometry, HSFCM)能对单个线粒体进行高灵敏、高通量、多参数定量分析的独特优势,本研究发展了一种单线粒体水平的荧光标记高通量评估方法。将携带靶向线粒体绿色荧光蛋白基因的pAcGFP1-Mito质粒转染至人宫颈癌HeLa细胞中,用G418筛选出稳定转染细胞,分别从瞬时转染和稳定转染的细胞中提取线粒体。此外,从未转染质粒的正常HeLa细胞中提取线粒体,分别进行MitoTracker Green标记以及SYTO 62线粒体DNA染色,应用实验室自行研制的超高灵敏流式检测装置在单线粒体水平对这4种线粒体标记方法的荧光亮度、标记效率和稳定性进行评估。实验结果表明,稳定转染细胞中单个线粒体的绿色荧光蛋白(GFP)荧光亮度为瞬时转染的17.7倍,比MitoTracker Green标记的线粒体亮度高约两个数量级,且标记稳定性好。本研究为线粒体标记方法的选择提供了一种先进的分析方法。