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聚合酶链反应用于高效的基因改造 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99%以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。 相似文献
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A thorough study on the reaction of 32_pN_p with 14 dinucleoside monophosphates including U_pI and C_p m~1I has been reported. The 10μl reaction mixture containing 100mM Tris (pH8.3), 40mMMgCl_2, 6.6mM DIT, bovine serum albumin (20μg/ml), 1mM ATP, 0.25mM dinucleoside monophos-phate, 0.05mM 32_pN_p and T_4 RNA ligase was incubated for 24 hr at 5--10℃ (or 2 hr at 37℃).The joining yields depend on the reaction temperature, the donor species and the base compositionof acceptors,_pC_p is the best donor. At 5--10℃, it can join in all 14 dinucleoside monophosphateswith yields ranging from 20% to 80%. The next one is _pA_p, but the yields are comparatively low.Both _pG_p and p_U_p are poor donors, which react with some dinucleoside monophosphates to give ayield of only a few percent, and sometimes no product could be obtained whatsoever. 相似文献
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本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75%,三十五核苦酸的连接率是90%,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21%。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。 相似文献
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We developed a general and efficient method for directing the deletions of DNA sequences of any lengths using polymerase chain reaction (PCR). The method was based on in vitro amplification of target sequences with site-specific deletions, Klenow end-flushing and blunt-end cloning. As an example, it was used to delete the restriction gene encoding EcoRI endonuclease, resulting in plasmids expressing two truncated forms. Assays using SDS-PAGE and gel retardation revealed the important role of the amphipathic helix (29-43) of the EcoRI endonuclease in binding to its cognate substrate. 相似文献
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本文报道采用有机合成与酶促合成相结合的方法,按照R.Holley等测定又经他人修正的一级结构,人工全合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的工作。我们合成的tRNA_y~(Ala)与天然的tRNA_y~(Ala)具有相同的化学组成(含有全部修饰核苷酸)和结构,并有完整的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,能接受丙氨酸,而且在兔网织红细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去。在进行全合成以前,曾分别进行了两种人工半合成,即将天然的5′半分子与人工的3′半分子和人工的5′半分子与天然的3′半分子进行连接,都取得有生物活力的整分子tRNA_y~(Ala)。据我们了解,这是世界上第一次用人工方法合成的具有生物功能的核糖核酸。 相似文献