毛细管电泳-限制性片段长度多态性分析检测胃癌H-ras基因点突变

建立一种毛细管电泳快速高效检测限制性内切酶酶切产物的方法, 使其更好地用于基因诊断. 以甲基纤维素(Methyl cellulose, MC)为筛分介质, 用pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) Marker标准DNA片段为实验对象, 通过考察筛分介质的浓度、pH值、毛细管的温度和运行电压优化出分离小于600 bp的双链DNA片段的最适条件, 并将此方法应用于临床59例胃癌患者肿瘤组织H-ras基因12位密码子点突变情况的检测. MC是一种良好的筛分介质, 运用其进行毛细管电泳对于遗传性疾病的诊断将更加快速、准确、简便、灵敏.     

毛细管电泳检测肺癌基因突变的方法学研究

建立了一种毛细管电泳快速高效检测聚合酶链反应(PCR)扩增产物以及限制性内切酶酶切产物的方法,使其更好地用于基因诊断.以聚环氧乙烷(poly(ethylene oxide),PEO)为筛分介质,用涂层的毛细管柱(37 cm×75 μm,有效长度27 cm)分离pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker标准DNA片段.考察了筛分介质的质量浓度、pH值、毛细管柱的温度和运行电压.在1×TBE (pH 8.2)电泳液、电压15 kV、温度15 ℃,于10 min内成功分离了Marker标准DNA片段.该方法快速、灵敏、准确,用于临床76例肺癌患者正常组织和肿瘤组织p53基因和ras基因点突变情况的检测,结果满意.     

毛细管电泳法检测肺癌p53基因第七外显子的突变

p53基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用,检测基因点突变的方法学研究将有助于临床准确诊断肺癌.本实验用PCR扩增包含249位密码子的肺癌及癌旁正常组织p53基因第七外显子,扩增样品分别经96 ℃变性和HaeⅢ酶切处理,以CE-SSCP、CE-RFLP、PAGE-SSCP和PAGE-RFLP对其突变情况进行检测,并从上样量、时间、检出限和检出率4个方面进行比较.PAGE凝胶浓度为15%;CE筛分介质PEO浓度3.0%,pH 8.2,电压15 kV,温度15 ℃,λex=488 nm,λem=520 nm荧光检测.检出率由高到低分别为:CE-SSCP>PAGE-SSCP>CE-RFLP>PAGE-RFLP.CE-SSCP可作为大规模肺癌早期诊断的简便可靠的方法.     

高效毛细管电泳用于以聚环氧乙烷为筛分介质分离DNA的机理研究

用毛细管电泳以聚环氧乙烷(PEO)为筛分介质对pUC19DNA/Msp Ⅰ(HpaⅡ)Marker中的12条DNA片段进行了分离,并尝试用Ogston模型、爬行模型以及线性模型对分离机理进行研究,最终发现26～147bp的小片段,在低电场强度时能很好地符合Ogston模型理论,而190～501bp中等长度的DNA片段电泳迁移率与其尺寸间存在很好的负相关的线性关系,为此,提出一种新的线性模型来进行解释.此外,还探讨了PEO的浓度和电场强度对分离的影响.其结论可更好地从理论上指导对中小片段DNA的分离,对肿瘤基因突变点的分析和PCR扩增产物的分离分析具有重要的意义.     

含有金纳米粒子的筛分介质对不同长度DNA片段的毛细管电泳分离

探讨了含有金纳米粒子(GNPs)的筛分介质在毛细管电泳(CE)中对不同长度DNA片段的分离.以聚环氧乙烷(PEO)-金纳米粒子(GNPs)-TBE为CE筛分介质,用涂层的毛细管柱(37 cm×75 μm,有效长度27 cm)分离DNA Marker D和1 kbp DNA Ladder Marker标准DNA片段,考察了CE过程中各参数(如筛分介质质量浓度、分离电压、温度和筛分介质pH值)对不同长度DNA片段分离的影响.对比了新型筛分介质与不含GNPs的PEO-TBE筛分介质的分离效果,并将新型筛分介质用于实际样品的检测.结果表明,在筛分介质中添加GNPs后能够改进CE的分离效果,且分离时间短.方法较适于分离较宽范围的DNA片段.     

肺癌组织蛋白质混合物检测方法学研究

采用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光法(NGS-CE-LIF)检测蛋白质,考察了分离条件对分离的影响,并对提取的肺癌组织蛋白质混合物进行分析,与毛细管电泳紫外检测(CE-UV)及常规蛋白质检测手段聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行比较.异硫氰酸酯(FITC)衍生蛋白质,筛分介质为0.05%(w/V) 聚环氧乙烷(PEO, Mr=300000),以TBE缓冲液 (pH 10.0)为电极缓冲液,分离电压为15 kV, 柱温15 ℃,氩离子激光器(λex＝488 nm, λem＝520 nm)检测.在此条件下可对6.5～200 kDa范围的蛋白质进行分离,分离效果较好,15 min内完成分离,理论塔板数(N)均值为9.12×104/m,检出限为0.28 mg/L.结果表明,本方法具有筛分介质浓度调节简便, 分离效果好, 时间短等优点,具有一定的实际应用价值;对提取肺癌组织蛋白质混合物进行检测,检测效率和效果优于CE-UV及PAGE.