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利用TiO2纳米棒与磷酸化肽的特异性相互作用,基于荧光偏振检测,建立了快速、简便的高灵敏度蛋白激酶活性分析方法. 在蛋白激酶催化作用下,荧光标记的肽底物被磷酸化,磷酸化的荧光肽通过磷酸基团特异性结合在TiO2纳米棒表面,从而使底物肽上标记的荧光分子的旋转速率发生改变,通过对荧光偏振度进行测量,可实现蛋白激酶活性的定量检测,该方法对蛋白激酶A(PKA)的检出限可达0.0004 U·μL-1. 此外,该方法还成功用于PKA抑制剂H-89的检测,在基于蛋白激酶抑制剂的靶向药物筛选方面具有很好的应用前景. 相似文献
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MicroRNAs（miRNAs）是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA (18–23 碱基)。MiRNA在动植物中普遍存在,并且在动植物的生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30%的基因受miRNA调控,并且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。MiRNA的定量检测和表达分析对深入理解其作用机制、疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。MiRNA检测一般是基于核酸杂交和扩增原理,方法主要有Northern印迹、微阵列芯片、原位杂交、实时反转录聚合酶链式反应（PCR）、滚环扩增和基于共轭聚合物的检测等。随着miRNA在不同生物中的大量发现和对其功能的深入研究,miRNA的检测方法不断改进和完善,新的扩增、探针标记技术和检测技术不断被开发。本文综述了miRNA检测方法的研究进展,评述了各类方法的优缺点,并对miRNA检测的发展趋势进行了展望。 相似文献
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利用以阳离子共轭聚合物为能量供体的荧光共振能量转移(FRET)策略和滚环扩增放大技术,建立了一种新型的microRNA(miRNA)检测方法。阳离子共轭聚合物采用聚[(9,9-双(6’-N,N,N-三乙基铵)己基)亚芴基亚苯基二溴化物](PFP)。PFP是一种由大量吸光单元共轭而成的阳离子聚合物,具有独特的光捕获和荧光增强性能,可以和带有负电荷的DNA通过静电作用相互结合。SG是一种能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的染料,其在游离状态下,荧光微弱,但一旦与双链DNA结合后,荧光会大大的增强。首先,设计了一条可与目标分子特异性杂交的锁式探针和与RCA产物序列互补的DNA链。当体系中存在miRNA时,在T4 DNA连接酶作用下,锁式探针连接成环;随后,在phi29 DNA聚合酶和dNTPs共同作用下,在miRNA的3’端滚环扩增出一条与锁式探针序列互补的长单链DNA,所得产物与互补DNA链杂交形成双链DNA(dsDNA)。此时SG作为FRET受体掺入其中,形成SG-dsDNA共同体。随后, SG-dsDNA与PFP因静电相互作用而紧密接近,由于PFP的发射光谱与SG的激发光谱有重叠,因此二者之间可以发生FRET现象。反之,当体系中不存在miRNA时,挂锁探针则无法连接成环,阻止了扩增反应的进行及其产物与互补DNA链的杂交反应。加入SG后,由于SG与单链DNA的结合能力很弱, SG则游离于溶液中,不会与PFP发生有效的FRET。因此目标分子的浓度与体系的FRET效率直接相关。以let 7a作为待测miRNA分子,在0.05~5 nmol·L-1的范围内, let 7a的浓度与从反应体系测得的FRET效率(I520/I423)成正比。同时以无PFP参加的检测方案作为对比实验,证明了PFP确实具有提高灵敏度的作用。另外,以四种同族miRNA分子及两种其他miRNA分子作为干扰物质对方法的特异性进行了考察,发现除了两种与目标分子序列高度相似的物质存在干扰外,其他物质几乎不产生信号。利用该方法对细胞总RNA提取液中let 7a的含量及其加标含量进行了检测,测量所得回收率基本令人满意。所建立的方案不需要荧光标记探针,有效降低了检测成本,简化了操作步骤,在与miRNA相关的疾病诊断领域具有一定的应用前景。 相似文献
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基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测. 相似文献
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