绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,用800 mg/L G418筛选2周后,在荧光显微镜下检测其表达.双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆,荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达.成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX-EGFP-C1-hri.     

猪内源性逆转录病毒与异种移植安全性问题

异种移植是将动物的活细胞、组织或器官移植给其它种类受者,其临床应用可以有效缓解同种供体移植物短缺,治疗人类终末期疾病。猪来源方便,易于繁育,与人体解剖和生理有很高的相似性,可选择合适大小的器官,因此成为异种移植较好的供体源。猪胰岛细胞临床应用治疗胰岛素依赖型糖尿病[1]、猪肾体外灌注用于治疗肾衰[2]、猪生物人工肝用于治疗人肝坏死[3]、猪心瓣用于治疗人心脏病[4]、猪神经细胞用于治疗人帕金森病[5],这些尝试给异种移植带来希望。然而,异种移植面临三个主要障碍,即移植物进入受者体内引发的免疫排斥反应,包括超急性排斥反应…     

FBXO6稳定表达肿瘤细胞系的构建及其亚细胞器定位

检测FBXO6在多种肿瘤细胞中的表达和定位情况并构建稳定表达FBXO6的肿瘤细胞株。运用RT-PCR方法,在人胚肾293T细胞以及9种不同来源的肿瘤细胞中,检测了FBXO6的表达情况。以载体质粒pBabe-3Flag-FBXO6-puro/pBabe-3Flag-con、包装质粒pCMV-GAG-POL及包膜质粒pCMV-VSVG用Lipofectamine2000共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定FBXO6的表达。利用激光共聚焦荧光显微镜,采用间接免疫荧光方法,检测外源性FBXO6在A549中的亚细胞定位。在10种不同来源的细胞株中,FBXO6在A549细胞中的表达最高。成功筛选出嘌呤霉素抗性细胞系A549-Con与A549-3Flag-FBXO6。Western blot方法发现A549-3Flag-FBXO6细胞系稳定表达FBXO6蛋白。间接免疫荧光发现FBXO6与内质网tracker有共定位。FBXO6在肺癌A549细胞中高度表达,构建了稳定表达FBXO6的A549细胞系,部分FBXO6分布在内质网中。     

反义c—myc重组逆转录病毒的制备及浓缩保存

将人ｃ－ｍｙｃ基因中从部分第一内含子到第二外显子和它３旁侧第二内含子的前８个核苷酸共１．５３ｋｂ片段，反向克隆于逆转录病毒离体ｐＤＯＲｎｅｏ中，构建了重组逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ＢＤ９，在Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导了将其导入包装细胞ＰＡ３１７，经过两轮亚克隆筛选，获得了单克隆，病毒滴度为１０＾６ＣＦＵ／ｍＬ的重组病毒分泌细胞株ｐＡＣ－ＢＤ９，它能稳定，高效地分泌含有目地基因片段的重组逆转录病毒颗粒ｐ     

反义人myc基因的表达对食管癌细胞恶性生长的抑制

本文构建了一个含有反义人c-myc基因片段(第三外显子及3’旁侧序列)的逆转录病毒载体——pDAM3.用磷酸钙沉淀法将pDAM3导入病毒包装细胞PA317,经过筛选获得病毒效价8×10~5CFU/ml的单克隆病毒包装细胞,DNA杂交分析证实病毒载体序列稳定地整合到PA317细胞中.利用DAM3病毒成功地感染了人食管癌细胞系EC8712,得到G418抗性细胞EC-DAM3,RNA杂交结果表明EC-DAM3细胞中存在着大量的反义mycRNA分子.EC-DAM3细胞的生长速率较之EC8712细胞下降50％,[~3H]胸腺嘧啶核苷掺入降低45％,细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力受到明显抑制.     

人乳铁蛋白基因的克隆及序列分析与重组逆转录病毒质粒载体PLNCX2-hLF的构建

从正常人外周血中性粒白细胞中提取总RNA，用RT-PCR的方法扩增人乳铁蛋白（hLF）cDNA，将其克隆到pMD18-T Simple载体上并测序．用限制性内切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ将目的片段与逆转录病毒载体PLNCX2进行双酶切、并用T4连接酶进行连接；然后转化到top10菌中，再次进行DNA序列测定．前后两次序列测定结果一致，没有突变，全长为2，136bp，说明所克隆的为hLF基因的cDNA序列；与GeneBank中登录的序列相比，同源性达99％以上．     

“功能性治愈”艾滋病成果凸显

正编辑圈点:逃脱艾滋的魔掌,似乎一直是个空想。但科学家们不信邪。2010年底,德国的胡特医生宣布世界首例被彻底治愈的艾滋病患者诞生,人们欣喜一阵而后绝望如常,毕竟是个     

逆转录病毒复制早期阶段中有关的细胞因子

逆转录病毒复制的早期阶段包括：病毒一细胞膜融合、逆转录、病毒的双链DNA整合插入宿主细胞染色体。在这些过程中，逆转录病毒必须利用若干细胞因子，诸如特异的细胞表面受体、细胞骨架的某些组分和核质转运有关因子。本书是关于逆转录病毒复制早期作用机制的专著。     

病毒学对分子生物学发展的贡献

本文通过回顾病毒学发展史上的重大事件，尝试从以下几个方面说明病毒学的新发现对分子生物学发展所做出的贡献：①噬菌体感染实验和植物病毒重建实验证明了核酸是遗传信息的载体；②逆转录病毒的发现使人们认识到遗传信息的流动不是单向的；③逆转录酶已经成为基因克隆中重要的工具酶；④朊病毒的发现使人们认识到蛋白质很有可能成为核酸之外遗传信息的载体，扩展了人们对中心法则的认识；⑤各种野生型病毒被改造成为基因工程载体，广泛应用于基因工程．