利用多重荧光定量PCR方法检测线粒体DNA拷贝数

为准确快速地检测出线粒体DNA拷贝数,建立新型多重荧光定量PCR(polymerase chain reaction)方案。该方案以高拷贝基因(300拷贝)替代以往单拷贝基因作为内参,减小线粒体拷贝数与内参基因拷贝数差异,同时,该方案在单管中检测线粒体和内参基因的拷贝数,消除了在不同管中检测内参基因和目的基因时的孔间差。此外考察了不同DNA抽提方法对线粒体DNA拷贝数检测结果的影响,并且构建质粒标准品(含有内参基因和线粒体DNA区段)。采用该方案检测100例中国人外周血样本线粒体DNA拷贝数,发现线粒体DNA拷贝数与年龄呈现负相关。该新型多重荧光定量PCR方案适用于大规模人群中线粒体DNA拷贝数的检测。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

虫荧光素酶N末端缺失

目的是通过虫荧光素酶Ｎ末端氨基酸的缺失,研究缺失对酶活性的影响。采用聚合酶链式反应的方法,构建虫荧光素酶Ｎ－末端缺失７,８,９个氨基酸残基的突变体,导入大肠杆菌ＤＨ５α菌株中直接得到表达,再分离纯化粗酶,并检测酶活。结果表明,Ｎ末端缺失７个氨基酸的突变体几乎没有活性（小于天然活性的０．５％）,Ｎ末端缺失８个以上氨基酸残基的突变体则完全丧失活性。由于Ｎ末端缺失６个氨基酸的突变体保持了７７％的酶活性,因而萤火虫荧光素酶Ｎ末端第７个氨基酸与酶的催化活性密切相关。     

双链置换探针实时PCR用于DNA池的等位基因频率测定

结合荧光双链置换探针的特异性和实时PCR的准确定量能力,建立了一种新颖、准确、价廉且高通量的测定DNA池等位基因频率的方法.该方法采用不同荧光标记的双链置换探针1次PCR反应即可测定出等位基因频率.实验以β 地中海贫血CDs41 42( TCTT)突变为对象,分别用荧光染料FAM和ROX标记野生型和突变型探针,由实时PCR检测建立的等位基因浓度与循环阈值的响应曲线计算DNA池的等位基因频率.结果表明,建立的系列等位基因浓度与循环阈值呈线性关系,线性相关系数分别为0.9977(野生型等位基因)和0.9938(突变型等位基因),可检测的最低等位基因频率达1%,等位基因频率在1%～90%范围内测定误差小于4%.该方法可广泛用于流行病学调查、遗传连锁分析以及全基因组连锁不平衡扫描等领域.     

乙型肝炎病毒聚合酶基因在重组腺病毒系统中的表达

乙型肝炎病毒是一种重要的人类病原,乙肝病毒聚合酶在病毒的复制中具有关键作用．拼接了HBV56的聚合酶全长基因,利用重组腺病毒系统,在HEK293细胞中表达乙肝病毒聚合酶．通过一种半定量PCR方法,检测到所表达的蛋白具有逆转录酶活性．这一研究对深入认识该酶结构与功能的关系,研制抑制病毒复制的药物,有一定的意义．     

本生烟组织培养及遗传转化体系的建立

本文研究了通过农杆菌侵染获得本生烟(Nicotiana benthamiana)转基因植株的方法。将本生烟中上部叶片消毒后切成5mm×5mm左右的小块作为外植体,在含有6-BA(3mg/L)和NAA(0.2mg/L)的MS培养基中培养2~3d,用含有表达载体的农杆菌侵染后共培养3~4d,转入含有6-BA(3mg/L)、NAA(0.2mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中培养2~3周。将外植体边缘产生的愈伤组织和芽点转移到只含有卡那霉素(100mg/L)的MS培养基中继续培养,2周后分化出大量不定芽。继续培养2周,当芽长1~3cm时,将芽转移到含IBA(0.1mg/L)的MS培养基中分化生根,得到再生植株。当再生植株高8~10cm、根长4~5cm以上时,移栽到经过灭菌的营养土中。通过实时荧光PCR扩增,从获得的植株中检测35S启动子和NOS终止子外源基因片段,判定所得的植株的确为转基因植株。最后对本生烟组织培养中应该注意的问题进行了讨论。     

广州地区早孕妇女HCMV感染及其垂直传播

用聚合酶链反应技术检测１１０例早孕妇女尿液及其胚胎绒毛的ＨＣＭＶＤＮＡ。结果孕母尿液与胚胎绒毛的ＨＣＭＶＤＮＡ阳性率分别为１５．５％和７．３％，宫内感染率为４１．２％，孕母尿液与胚胎绒毛的ＨＣＭＶ阳性数密切相关，提示孕母尿路排毒系全身性活动性感染；孕母尿液ＨＣＭＶ阳性与阴性者其胚胎绒毛ＨＣＭＶ阳性数具显著差异，表明孕母尿液阳性者较阴性者处于垂感染胚胎的高危状态，建立采用ＰＣＲ法普查早孕妇女尿液ＨＣ     

D38R突变对细菌视紫红质光循环后半程M态和N态的影响

用重叠PCR的方法，定点突变细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），克隆到单突变体BRD96N和双突变体BRD38R/D96N的基因，同源转化盐沼盐杆菌（Halobacterium salinarium）L33（BR），表达突变蛋白BRD96N和BRD38R／D96N通过显微视频方法对突变BR的M态光致变色特性进行记录，BRD38R／D96N的M态寿命为5s，约为BRD96N（M态寿命为3s）的1．7倍．对突变体的激光共聚焦拉曼光谱测定发现，在BRD96N中，1170cm^-1下移到1171cm^-1，1258cm^-1上移到1255cm^-1，而BRD38R/D96N中1170cm^-1下移到1173cm^-1；1258cm^-1。上移到1252cm^-1，而且BRD38R/D96N与BRD96N相比，1186cm^-1处的峰明显增强．近紫外区圆二色谱显示，两种突变体近紫外区的正负带虽然没有太大差别，但288nm和290nm处的极峰却差别显著．所有这些研究结果表明，细菌视紫红质Asp38（D38）突变为Arg（R）可以延长其光循环后半程M态和N态的寿命．     

连续流动式聚合酶链式反应生物芯片/微装置中脱氧核糖核酸样品的驱动控制技术进展

介绍国内外连续流动式聚合酶链式反应生物芯片／微装置中脱氧核糖核酸样品的驱碧控制技术进展，主要包括恒流泵（注射泵驱动和蠕动泵驱动）、旋转泵驱动、磁流体动力驱动以及自然对流驱动等。并对这几种驱动方式的优缺点作简要的讨论（引用文献43篇）。     

中国人CD59cDNA克隆、序列分析及其表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人胚胎总ｍＲＮＡ中扩增出４２０ｂｐ人补体终末阶段同源限制因子（ＣＤ５９）的ｃＤＮＡ，序列分析结果表明，所获得的ＣＤ５９ｃＤＮＡ与文献报道中的基因序列完全一致，含ＣＤ５９全长编码区．构建了真核表达质粒，在３Ｔ３细胞中得到了表达．