高致病性猪蓝耳病的综合防制

夏秋季是高致病性猪蓝耳病的高发季节，今年防控形势依然严峻。目前该病虽暂未被列入一类动物疫病，但如果防控不好，将严重危害养猪业的持续健康发展，使养殖者蒙受重大经济损失，同时还影响到猪肉消费市场的稳定。     

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达

酵母转录因子GCN4是通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质之一，当GCN4二聚体与DNA结合时，亮氨酸拉链区的2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构，而其基区由无规线团结构变为α螺旋．为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理，设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需氨基酸的折叠片段，并将其克隆到Escherichia coli BL21，讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件．在蛋白质的小量表达试验中，重组子Escherichia coli BL21于5mL含有50μg／mL氨节青霉素和34μg／mL氯霉素的LB液体培养基中培养至对数期，加入不同浓度的IPTG，继续培养以诱导蛋白质的表达，在不同的时间(如：诱导前，诱导2，4，6，8h)取样100μL到1．5mL离心管中、离心收集沉淀，将沉淀悬浮于样品缓冲液中，用10％SDS-PAGE检测；在10L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中进行了大量表达，根据小量表达的试验结果确定了IPTG的浓度和诱导时间．结果表明：含有这种拉链蛋白质的重组子Escherichia coli BL21在37℃下小量培养时，0．1-0．8mmol的IPTG均可在2-10h内诱导该蛋白质表达；而大量培养时，0．2mmol和0．4mmol的IPTG在37℃均不可能诱导表达，只在28℃时才表达；小量培养和大量培养的最佳诱导时间为4-6h，诱导剂IPTG的浓度为0．2mmol，大量表达的温度为28℃而不是37℃．     

毛细管区带电泳法对不同表面特征大肠杆菌的快速表征

采用毛细管区带电泳法对肠毒素大肠杆菌的 3种亚型 (E .coliK99、987P和K88) ,进行以细菌细胞为单位的快速表征 ,探讨了不同表面特征的细菌细胞在电泳图上的差异 .结果表明 ,在相同电泳条件下 (0 0 2 5mol/LNa2 CO3 -NaHCO3 (pH9.9)缓冲液 ,检测电压 14 .1kV ,检测波长 2 10nm) ,E .coliK99、987P和K99的细胞分别具有单一、稳定 (RSD≤ 0 9% )的特征谱峰 ;细菌细胞经去菌毛鞭毛处理及甲醛灭活处理 ,电泳行为差异显著 ,且不同处理方法之间的变化具有一致性 .     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）。利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＥＸ。ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表     

具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒pKK232-8 为载体,用4 组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌R1(Halobacterium halobium )的染色体DNA,在体外进行重组,转化E.coliDH-5α感受态细胞,得到12 个转化子(T1～T12),其抗性水平分布在10～500 m g/L的区间内. 将这些转化子所含质粒分别命名为pSX1～pSX12,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源DNA 片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子T11 所含质粒pSX11 上插入了一段来源于盐生盐杆菌R1 染色体的DNA 片段. 该DNA 片段在大肠杆菌中具有启动子功能.     

重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

人脑钠素(hBNP,humanbrainnatriureticpeptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素.临床研究表明,hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物.化学合成脑钠素全基因,以pET32a为表达载体,构建了硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin＿hBNP)融合蛋白表达质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25%以上.融合蛋白经肠激酶裂解、Zn＿Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析,从每升培养液中可获取4mgrhBNP,纯度达到95%.经质谱测定,rhBNP样品的分子量为3464Da.体外活性测定结果表明,rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应,其ED50为(2.24±0 58)×10-6mg/mL.     

重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化和鉴定

用PCR将化学合成的人胸腺肽α1基因扩增并克隆到pMD18-T载体中,经过KpnI／SacI酶切、连接将胸腺肽基因插入到表达载体pET32b中硫氧还蛋白下游．将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Zn—Sepharose亲和层析纯化以及复性处理,从每升菌液中可获得35mg硫氧还蛋白-胸腺肽α1融合蛋白．经凝血因子Xa酶切、Zn—Sepharose亲和层析以及反相高效液相色谱纯化获得3．8mg重组人胸腺肽．小鼠胸腺细胞凋亡实验表明,重组人胸腺肽能显地抑制地赛米松诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡,且该抑制作用与重组人胸腺肽的浓度呈剂量依赖关系．     

Modification of the rib operon derived from Bacillus subtilis and its expression in Escherichia coli

A riboflavin operon （rib operon） derived from Bacillus subtilis 368 was modified on structure and the resulting operons were expressed in various strains of Escherichia coli. The results showed that the optimization of the rib operon and the host strain used for expression are two main factors affecting the riboflavin production. Replacing the promoterl and rfn box of the rib operon with a strong constructive promoter spol drastically increased the expression of the rib genes. When E. coli JM109 was used as the host strain, the highest riboflavin production reached 95.3μg/mL （about eight times higher than that of the unmodified r/b operon）. In addition, when tetracycline （20 μg/mL） was used as the selective pressure, compared with the ampicillin resistant transformants, a higher riboflavin yield was obtained in tetracycline resistant host strain.