北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶基因的分子克隆与原核表达

运用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)铜锌超氧化物歧化酶(命名为ScCu/Zn-SOD)基因,该基因的cDNA序列全长为804bp,开放阅读框为465bp,编码154个氨基酸。氨基酸序列中含2个Cu/Zn-SOD标签序列、7个铜锌金属结合位点、2个半胱氨酸位点和1个N-糖基化位点;其与胞内Cu/Zn-SOD(icCu/Zn-SOD)和胞外Cu/Zn-SOD(ecCu/Zn-SOD)氨基酸序列的同源性分别为60.13%~92.21%和33.77%~42.21%。在系统进化树中,ScCu/Zn-SOD与其它物种的icCu/Zn-SOD聚成一支。ScCu/Zn-SOD的蛋白晶体结构主要由2个α螺旋和8个β折叠组成,呈β折叠构象,通过结合1个Cu2+和1个Zn2+构成其酶活性中心。ScCu/Zn-SOD的mRNA在翘嘴鳜肌肉、鳃、肝脏和肾脏等组织中均有表达,且鳃中的相对表达量最高。将该基因编码蛋白序列与pET-30a表达载体重组,热激转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测发现诱导后菌液的超声上清中有可溶性重组蛋白表达。     

G/11木聚糖酶最适pH值的预测及其与氨基酸位置的关系

把木聚糖酶全序列均分为N端,中间端(I端)及C端3个部分,并分别以全序列及分段氨基酸的组成作为模型输入值.通过主成分分析(PCA)方法探讨全序列及分段氨基酸组成和最适pH值的相关性,运用均匀设计法分别优化支持向量机和BP神经网络运行参数.研究结果表明:支持向量机获得的预测模型优于神经网络,其中RBF支持向量机是最佳的模型.主成分分析结果显示:I端主成分跟最适pH值相关性最高;相关系数R绝对值为0.68,得到的结果与支持向量机结果一致.     

Cloning and analysis of [NiFe]-hydrogenase genes from Arthrospira platensis FACHB341

0IntroductionHydrogenase(H2ase)has beeninvestigatedin a va-riety of bacterial groups since it was firstly reported in1931[1-3].Cyanobacteria contain two different types ofH2ase,uptake H2ase(EC1.12.7.2)and bidirectional orreversible H2ase(EC1.12.1.12).Uptake H2ase is in-duced under N2-fixing situation,mainly confinedin hete-rocysts.Bidirectional H2ase is constitutively synthesized,active in both heterocysts and vegetative cells present inboth N2-fixing and non-N2-fixing conditions.This en…     

何首乌中一种Ⅲ型PKS基因的克隆及生物信息学分析

Ⅲ型聚酮合酶即查耳酮合酶超家族,能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、含有查耳酮合酶基本骨架的植物次生代谢产物。根据不同植物Ⅲ型PKSs基因的保守序列,设计简并引物,采用RT - PCR和RACE技术,首次从传统中药材何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)中克隆到一种Ⅲ型PKS基因,其cDNA全长1228bp, 编码379个氨基酸,命名为FmPKS (GenBank登录号: GQ411431)。该基因含有三个内含子, 与迄今报道的绝大部分Ⅲ型PKS含有一个内含子不同,而与最近报道的虎杖中克隆的PcPKS2基因相同。通过生物信息学方法对其编码蛋白的序列进行同源性分析,构建了系统进化树,并对其等电点、疏水性及二级结构、跨膜区域等理化性质进行了初步预测,为进一步研究其功能奠定了基础。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基基因的克隆和表达分析

根据拟南芥等G蛋白β亚基基因的DNA序列,采用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆了一个编码G蛋白β亚基基因的全长cDNA,命名为BnAGB1.BnAGB1含有1134 bp的完整开放阅读框,编码378个氨基酸,与其它植物的Gβ亚基氨基酸序列有很高的同源性,且具有保守的Gα、Gγ结合区域及WD-40结构域.对甘蓝型油菜矮化突变体及其野生型中不同组织和不同发育时期的BnAGB1表达进行实时定量PCR分析表明:BnAGB1在矮化突变体和野生型的各个组织中均有表达;在生长旺盛期的子叶期、抽薹期和荚果期有较高的表达,而在两片真叶期、四片真叶期和花期表达较低;而且,在所有分析的不同时期和组织中,矮化突变体中的表达均显著或极显著高于野生型.以上结果表明,BnAGB1参与了甘蓝型油菜的生长发育进程的调控,与油菜矮化突变性状表现可能相关.     

棉花半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达与活性研究

通过从已构建好的突变体湘棉-18的cDNA文库中筛选分离出一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的全长cDNA序列,经测序和序列分析,发现该片段包含一个完整的开放阅读框,长378个碱基,编码125个氨基酸,氨基酸序列中包含了一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的保守区段Gln-Val-Val-Ala-Gly;信号肽预测发现该序列包含一个N端信号肽,保守区分析该基因编码的氨基酸包含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂相似区域.半胱氨酸蛋白酶抑制剂在大肠杆菌中表达重组蛋白,在条件为30℃,IPTG 5mmol/L,时间24～36h时,CPI实现最优表达,Western Blotting分析表明表达的蛋白正确.通过木瓜蛋白酶活性抑制实验,结果表明该重组CPI具有一定的酶活抑制作用.     

人脑蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1基因克隆与原核表达

从人脑组织中提取mRNA,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重组质粒.将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,筛选阳性克隆进行验证,将测序正确的质粒转化到E.coli Transetta感受态细胞中表达SHP-1.进一步对SHP-1表达的诱导温度和IPTG浓度等条件进行优化.结果显示,所克隆的SHP-1基因片断经PCR鉴定和测序分析,与目标基因完全相符.通过蛋白表达条件的优化,发现20℃,0.4mmol/L IPTG对表达菌株进行诱导时,SHP-1可溶性蛋白表达量最大.     

鲈鱼cxcr4 cDNA克隆和序列分析

趋化因子受体(cxcr4)是一类重要的免疫调节因子受体,对原始生殖细胞的迁移和存活具有十分重要的作用。在对脊椎动物cxcr4进行初步生物信息学分析基础上设计引物,采用RT-PCR和RACE相结合的方法从鲈鱼卵巢克隆了cxcr4a全长和4b部分cDNAs序列,并预测其编码的氨基酸序列。结果表明,由于鱼类基因组经历一次特有的复制,cxcr4在鱼类存在两个复制基因。鲈鱼cxcr4a cDNA全长为1432 bp,编码311个氨基酸;cxcr4b部分cDNA片段长为905 bp,编码285个氨基酸。将鲈鱼cxcr4序列与所有已克隆的硬骨鱼类进行同源性比较,结果显示硬骨鱼类保守性较高,所有已经克隆的cxcr4按照进化地位的不同成簇聚类,表现出了较高的同源性。