抗稻瘟病细胞突变体筛选技术体系的建立

以稻瘟病菌粗毒素提取液为选择压,选取籼稻材料缙2B、缙恢36和缙恢10进行抗稻瘟病突变体的筛选．结果表明：1）在成熟胚诱导产生愈伤组织过程中,2,4-D是诱导愈伤的关键因子,3种材料在附加2mg／L2,4-D的NB培养基（NBD2）上诱导产生的愈伤较好．2）粗毒素对3种材料的胚根、胚芽、愈伤组织的生长都有着明显的抑制作用,表明粗毒素具有一定的致病力,其毒性并不与浓度完全成正比关系,而是在一定范围内随浓度的增加而增加．在毒素浓度为45％时,缙2B胚根和胚芽生长受到抑制的程度最大,而缙恢36和缙恢10则在30％浓度中生长受到明显抑制．3）粗毒素对3种材料的愈伤组织成活率及再生频率有着明显的抑制作用,其程度随浓度的增加而增大,当稻瘟病粗毒素浓度为60％时,愈伤组织不生长,并变褐死亡,最终选择45％的毒素浓度进行2次继代抗性筛选并获得再生植株．     

细胞色素b5 S64X突变体对蛋白结构及稳定性的影响

为了深入了解细胞色素b₅(Cyt b₅)64位氨基酸残基(Ser64)对血红素辅基微环境及蛋白性质的影响,我们分别对Cyt b₅ Ser64进行了保守性突变(S64T)以及非保守性突变(S64K、S64N和S64H),均为亲水性氨基酸残基。对野生型细胞色素b₅及其突变体蛋白S64X(X：T,K,N或H)的热、酸、盐酸胍变性的稳定性研究表明：4个突变体蛋白的稳定性相对于野生型都大大降低了;CD光谱表明,细胞色素b₅ S64X突变体中的α-螺旋明显减少,芳香性氨基酸残基所处的肽链结构受到了影响;盐酸胍变性荧光光谱表明,Trp22周围的蛋白肽链受到了影响,Trp22暴露于水溶液的程度加大。我们认为Ser64不仅对血红素辅基有稳定作用,同时还对维持蛋白Core 1中的第5个α-螺旋结构有重要的作用,在64位引入其他氨基酸残基影响了第5个α-螺旋的结构,并通过蛋白肽链的相互作用,使得Trp22所在的Core 2结构也受到了较为明显的扰动。     

球状功能性烟草花叶病毒纳米颗粒的制备及表征

烟草花叶病毒(TMV)由于其良好的生物相容性、单分散性、多价性、低成本等优点,已作为功能材料的基本构筑单元应用于光电器件、组织工程、疫苗载体,无机纳米材料制备等研究领域。然而,相比于棒状的TMV,球状TMV纳米颗粒无核酸分子,抗环境影响能力更强,比表面积更大。本文利用蛋白质的热致变性原理,对经基因和化学改性后的棒状TMV如半胱氨酸突变体(TMV-Cys)、赖氨酸突变体(TMV-EPMK)和β-环糊精(β-CD)修饰的TMV(TMV-β-CD)进行热变性处理,探究其形成球型纳米颗粒(TMV-SNP)的能力及功能性。结果显示,改性后的TMV经历热变性后可得到形貌均一的球型纳米颗粒,且其暴露在纳米颗粒表面的功能基团Cys、Lys和β-CD仍具有反应活性。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和层析填料的制备及应用

研究用交联琼脂糖为载体,三聚氯氰为活化剂,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基,制备亲和填料的方法.通过紫外和红外光谱分析,对制备的填料进行表征.用制备的亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase,r-PA),研究吸附与解吸附条件.结果表明,用该方法制备的亲和填料,制备工艺简单,吸附性能良好,对r-PA的吸附量为8.76 mg·g-1.解吸附完全,不影响活性,可以用来分离纯化r-PA.     

Fine mapping and cloning of MT1,a novel allele of D10

Rice tillering is an important determinant for grain production.To investigate the mechanism of tillering,we characterized a multiple tillering mutant (mt1) identified from the japonica variety,Zhonghua 11,treated with EMS.This mutant exhibits advanced tillering development and dwarfed compared with wild-type plants.Genetic analysis and fine gene mapping indicated that the mt1 mutant was controlled by a recessive gene,residing on a 29-kb window on AP003376 of chromosome 1.One putative gene in this region,encoding a carotenoid cleavage dioxygenase 8 (CCD8),was allelic to D10.The mt1 mutant phenotype was complemented by introduction of wild-type MT1,and knockdown of MT1 in wild-type rice mimicked the mutant phenotype.Real-time PCR analysis indicated that the MT1 gene is expressed highly in stems and at a low level in axillary buds,panicles,leaves,and roots.In addition,MT1 expression is clearly under feedback regulation.     

拟南芥叶色突变体ems3的基因定位

ems3是经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变筛选得到的一拟南芥叶色突变体.通过背景纯化与遗传分析,发现ems3突变体是单基因隐性控制.利用图位克隆的方法对叶色基因EMS3进行了定位,结果表明:EMS3位于第5条染色体分子标记MHF15和MHF152之间55kb的区间内.生物信息预测,该区间包括有16个基因.这些结果为该基因的克隆及叶绿体发育过程中的功能研究奠定了基础.     

水稻线粒体tRNATrp种属特异性元件研究

为了研究水稻线粒体tRNATrp的种属特异性元件,在野生型水稻线粒体tRNATrp的基础上,设计并完成了3种向人tRNATrp的突变,体外转录并用枯草杆菌和人这两种不同种属来源的色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)测定了这些 tRNATrp 分子的氨酰化活力(Kcat/KM).结果表明,与野生型水稻线粒体tRNATrp相比, 3个突变体被人TrpRS氨酰化的活力分别提高了354、407和803倍,其中以PMPH3(水稻线粒体tRNATrp的氨基酸接受茎的C2-G71和G3-C70都突变为人tRNATrp的氨基酸接受茎的相应部位)的氨酰化活力改变最大.而3个突变体对B.subtilis TrpRS氨酰化活力有进一步负影响,氨酰化活力微弱.说明水稻线粒体tRNATrp氨基酸接受茎上的第2个碱基对C2-G71和第3个碱基对G3-C70在人色氨酰-tRNA合成酶识别过程中有着极为重要的作用,是水稻线粒体tRNATrp的种属特异性元件.     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶突变体MEKK3的构建及功能鉴定

有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase 3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于MAP3K(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase)家族,其在细胞增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤的发生中发挥了重要的作用。本文利用分子克隆手段构建激酶功能失活(kinase inactive)型突变体MEKK3KI(391位赖氨酸突变为甲硫氨酸,K391→M391)的真核表达载体,并通过检测MEKK3KI对NudC的磷酸化作用及对细胞周期的影响以鉴定其激酶活性。根据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3(MEKK3WT)的目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增激酶功能失活型MEKK3KI目的基因,并将其分别克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c和带有GFP标签的真核表达载体pEGFP-C1中。DNA序列分析结果显示,MEKK3KI基因序列成功将391位点的赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M),表明突变体构建成功;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3KI重组体均在HeLa细胞中高效表达;体外模拟磷酸化实验结果显示,野生型MEKK3WT在体外可以磷酸化NudC,而激酶功能失活型突变体MEKK3KI无法将其磷酸化;激光共聚焦显微镜观察发现,野生型MEKK3转染HeLa细胞,细胞核形态异常,与凋亡细胞核形态相似,而失活型MEKK3过量表达不会导致细胞核明显变化。总之,本实验成功构建了野生型、失活型MEKK3的真核表达载体,为进一步揭示MEKK3生物学功能奠定了基础。     

坛紫菜色素突变体产生原因的初步研究

以6种不同颜色的坛紫菜(Pyropia haitanensis)品系为研究材料,通过生理指标测定和转录组测试分析,对坛紫菜色素突变体产生的原因进行初步研究。根据色度值将6个品系划分为红黄组和绿组,其中:红黄组包括3个色素突变品系(红色、橘色和紫色)和1个野生品系,绿组包括2个色素突变品系(棕绿色和翠绿色)。进一步研究发现:1)红黄组品系的平均藻红蛋白(PE)含量比绿组高1倍,但两组藻体在藻蓝蛋白(PC)和别藻蓝蛋白(APC)含量上没有显著差异。2)红黄组藻体的平均叶绿素(Chl a)含量比绿组低35%,这导致红黄组藻体的PE/Chl a含量比绿组高1.7倍。3)红黄组藻体藻胆蛋白合成关键基因血红素氧化酶(HMOX1)和铁氧还蛋白氧化还原酶(HY2)的表达水平高于绿组。4)两组内不同品系间在色素合成关键基因的表达上具有显著差异。其中,叶绿素和藻胆蛋白合成的关键基因hemA的表达水平上调,促进更多色素的合成;叶绿素合成关键基因Mg-鳌合酶亚基和CHLG表达水平上调,调控藻体合成更多Chl a,使得藻体呈绿色;而HMOX1和HY2明显上调,促进血红素合成胆绿素,最终提高PE含量,使藻体偏红色。以上结果说明,坛紫菜藻胆蛋白和叶绿素合成通路中关键基因的差异表达可能导致藻体PE/Chl a含量比的不同,进而产生不同颜色的突变体。     

拉曼光谱法鉴定水稻叶绿素缺乏突变体

植物叶色变异是自然界普遍的现象,叶色突变体已广泛应用于基础研究和生产实践.利用拉曼光谱测定了水稻叶色黄化突变体叶片的叶绿素含量.研究结果显示:在拉曼光谱图中·叶绿素的特征峰(1155,1527cm-1)在突变体中强度较野生型有很大的下降,表明突变体中总的叶绿素含量较低;紫外分光光度计的测定结果表明该突变体的叶绿素含量比野生型降低,且叶绿素b的含量极低,证实了拉曼光谱所反应的信息;拉曼光谱法可以用来快速鉴定植物活体的叶绿紊含量.本研究尝试利用拉曼光谱测定活体生物的叶绿素含量的可行性,为今后发展便携式、快速、准确、无损伤鉴定叶绿素含量及其他生物质含量的方法和开发相关仪器提供研究思路.