四川S.suis2强毒株溶血素样蛋白HLP序列信息分析及克隆表达产物活性检测

对四川猪链球菌2型(S.suis 2)强毒株05ZYH33溶血素样蛋白(hemolysin-like protein,HLP)编码基因hlp进行序列信息分析、分子克隆表达及溶血活性检测,深入探讨HLP的致病机制.用Blast和Clustal X程序对HLP进行基因同源性分析,用Signal P 4.1和TMHMM Server 2.0分析HLP氨基酸序列.设计合成hlp引物进行PCR扩增,先后将hlp克隆入p MD-18T载体和p ET30a表达载体中,构建p ET30a::hly原核表达质粒.将重组质粒转化至E.coli BL21中诱导表达,并对重组HLP蛋白进行纯化和溶血活性检测.同源性分析表明HLP与多种具有溶血活性的蛋白相似性较高.氨基酸序列分析发现HLP具有信号肽和跨膜区,且由DUF21、CBS和Cor CHly C 3部分组成.序列测定显示hly片段全长1 335 bp,编码445个氨基酸.重组质粒经诱导表达和纯化后电泳显示,HLP分子量约为70 k Da,具有溶血活性.结果表明,HLP是一个膜结合蛋白,不同于能够分泌到细胞外的溶血素Suilysin.重组HLP具有一定的溶血效价,此可能与致病相关.     

GC-NCI/MS法分析海水中得克隆类物质

建立了固相萃取-气相色谱-负化学源质谱联用法(SPE-GC-NCI/MS)同时测定海水中5种得克隆类物质的方法。采用二氯甲烷进行液液萃取(LLE),萃取液经过硅胶固相萃取小柱净化后,在15 m长的DB-5HT高温毛细管气相色谱柱上分离,NCI/MS以选择离子监测模式检测目标化合物。方法中5种得克隆类物质Dec 602,Dec 603,Syn DP和Anti DP的检出限分别为0.01,0.01,0.08,0.02和0.01 ng/L,平均加标回收率分别为61%,75%,75%,87%和91%,RSD均小于5.1%。采用该法对河北近岸海域16个采样站位海水样品进行分析,所有采样站位均有得克隆类物质检出。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

ω-3转基因克隆绵羊诞生

我们构建了含有bfat-1表达载体pIE-bF1,通过脂质体介导转染获得转基因细胞系,再以核移植技术获得转基因克隆胚胎。胚胎移植后,于2010年10月27日出生两只克隆羊。经检测均为转ω-3基因克隆绵羊。     

ptr-MIR156a启动子克隆及特征分析

miR156a在火炬松、烟草、拟南芥中的表达与病原菌侵染密切相关。为了研究miR156a在杨树与病原菌互作过程中分子机制,以毛果杨全基因组DNA为材料,预测ptr-MIR156a启动子的大概区域,设计特异性PCR引物,克隆了ptr-MIR156a上游启动子区500、1 000和1 500 bp片段,并进行顺式作用元件分析,然后分别构建了绿色荧光蛋白(GFP)报告基因植物表达载体,最后通过原生质体的瞬时表达体系对其进行了活性检测。结果表明,1 500 bp片段活性最高,1 000 bp片段次之,500 bp片段活性最低。     

Expression of Catalytic Domain of Protein Tyrosine Phosphatase 1B and Preparation of Its Polyclonal Antibody

This study focuses on the expression of human protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B) catalytic domain (△PTP1B) and preparation of polyclonal antibody against △PTP1B. △PTP1B gene was PCR amplified with the cDNA of human PTP1B as the template, and cloned into the pT7 expression vector. The recombinant pT7-△PTP1B was expressed in E. coli Rosetta( DE3 ) host cells and purified. The antiserum was prepared by immunizing rabbit with purified recombinant △PTP1B. The polyclonal antibody against △PTP1B was purified by PVDF immobilized antigen affinity chromatography. △PTP1B was correctly cloned, expressed, and purified as confirmed by PCR, DNA sequence ratio) and 0. 1 ng, respectively. This study provides an important basis for further studying the biological function of PTP1B and its relationship with human diseases.     

一种基于免疫抗体聚类算法的复杂函数寻优

通过在克隆选择过程中引入抗体聚类机制,提出了一种用于复杂多模函数优化的新算法.通过聚类将抗体群分成多个子种群来实现其克隆选择策略,加速克隆扩增,从而提高抗体成熟力及亲和性.采用了混合超变异算子,使其能快速获取全局及局部最优.实验仿真结果表明:该算法对复杂函数寻优的过程是相当有效的,具备良好的全局和局部收敛可靠性.     

克隆植物结缕草在两种环境中的生长发育特征

以克隆植物结缕草为对象,研究了其在温室内、外两种环境条件下的生长发育特征.结果表明：在相同环境条件下,主匍匐茎上的复合节、根、Ta和Tb分蘖的形成顺序依次后移,且形成速率均呈相互平行的直线关系.但在温室内,主匍匐茎上的复合节及其它器官的形成时间一般均较温室外晚.复合节间的形成是逐渐完成的,在温室外,一个复合节间的70%完成于该复合节形成后和下一个复合节间形成前,而其余则完成于下一个复合节间形成之后.在温室外,二级匍匐茎上复合节及其它器官的形成规律与主匍匐茎相似,但Tb的形成速率较慢.这与各级匍匐茎之间以及各相应构件器官之间资源传输与分配格局存在差异有关.通过主匍匐茎的向前直线型生长和次级匍匐茎的侧向伸展,结缕草分株被放置到更加广阔的生态空间,分株种群规模扩大,资源摄取能力增强,从而有助于提高结缕草的生态适应性和种间竞争能力.     

国产大蒜凝集素基因的克隆与生物信息学分析

为了获得国产大蒜新的凝集素家族基因,根据NCBI数据库中已公布的大蒜凝集素基因序列设计引物,从国产大蒜的鳞茎中提取总RNA,采用RT-PCR技术分离克隆出一个大蒜凝集素基因,命名为ASA-C。ASA-C全长546 bp,包含1个471 bp的ORF,编码156个氨基酸的多肽。利用网站和分析软件对其进行生物信息学分析。结果 表明：ASA-C与已公布的同源二聚体大蒜凝集素ASAⅡ基因具有较高同源性;推测该基因编码多肽的N端有一典型跨膜结构域的信号肽,多肽序列上有3个甘露糖特异性结合凝集素共有基序（Q-D-N-V-Y）。多重序列比对以及系统进化树的结果 表明大蒜凝集素的保守性很强,这为进一步开发利用大蒜凝集素蛋白的功能奠定了基础。     

池蝶蚌HsTRAF6基因的克隆鉴定及表达分析

肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）对于介导Toll样受体（TLR）/白细胞介素1受体（IL-1R）信号传导以及随后的NF-κB和AP-1的激活至关重要。在本研究中,已经克隆并鉴定了池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）TRAF6（以下简称HsTRAF6）,cDNA全长为3 945 bp,ORF框1 965 bp,编码654个氨基酸,该区域包含保守的特征结构域,包括1个RING结构域、2个TRAF型锌指结构域、1个典型的卷曲螺旋（coiled coil;TRAF-N）和MATH（TRAF-C）结构域。系统发育分析显示,池蝶蚌与其他贝类等软体动物聚在一支。此外,qRT-PCR分析显示HsTRAF6在组织中广泛分布,在鳃和肝胰腺中表达最丰富;脂多糖和嗜水气单胞菌免疫刺激后,分别在7个时间点（0,6,12,24,36,48,72 h）对10个组织中HsTRAF6的mRNA表达差异性进行分析,各组织间表达变化存在差异,但均有显著变化。