体细胞克隆技术在企业肉羊繁殖生产中的初步应用

虽然体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)的总体效率不高,但其潜在的开发价值仍值得尝试.本试验与企业密切合作,并以企业为开发主体,开展优秀杜泊种公羊的克隆生产与应用研究.结果表明,舍饲条件下的受体母羊比草原放养母羊更适合于作克隆胚胎移植受体,同期发情处理方式与胚胎运输影响克隆胚胎的妊娠效率.在过去3年间,共有100只受体羊妊娠至3个月以上,妊娠率为13.6%.目前有61只健康存活.其中一部分克隆公羊作为种羊与本地蒙古羊配种,参与企业的肉羊繁殖生产.由此可以看出,以企业为主体的利用克隆技术进行优秀种羊规模化生产是可行的.     

猪生长激素cDNA基因的改建

为了将猪生称激素cDNA基因在表达后能一步纯化获得表达产物,对于来自质粒的猪生长激素cDNS基因通过PCR技术进步了改建,进一步的序列分析表明,与GenBank登录的序列不同,改建后的基因不带有突变。     

地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶产麦芽糖特性研究

为了开发新的生产麦芽糖浆的淀粉酶,在大肠杆菌中表达了一个地衣芽胞杆菌(Bacillus lichen form is)麦芽糖α-淀粉酶,并对该酶产麦芽糖的特性进行研究.结果显示,重组酶分子大小为65 kDa,以淀粉为底物的最适温度为45℃,最适pH值为6.5.以浓度为20％的可溶性淀粉为底物,加入106U/g淀粉的地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶,反应48h,采用HPLC检测产物,产物中只有葡萄糖和麦芽糖,其中麦芽糖含量为52.21％,还原糖得率为72.1％;当加入1U/g淀粉的普鲁兰酶协同作用进行反应时,产物中麦芽糖的含量增加到57.16％,还原糖得率增加到92.5％.该酶在麦芽糖浆的工业生产上有较大的潜在应用价值.     

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）IL-10基因的克隆及表达分析

白细胞介素10（IL-10）是一种作用广泛的抗炎细胞因子，主要功能是限制和最终终止炎症反应. 用RACE （rapid amplification of cDNA ends）-PCR方法扩增出鲢白细胞介素10（IL-10）的cDNA，其全长为1248nt，包含5′非编码区156nt，3′非编码区552nt，开放阅读框540nt．鲢IL-10的开放阅读框编码179个氨基酸，其中包含构成两对二硫键的4个保守半胱氨酸．RT-PCR结果显示鲢IL-10mRNA主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达．将鲢IL-10完整开放阅读框克隆到原核融合表达载体pET-32a-c（+）上，转入大肠杆菌Rosetta-gami（DE₃） 内进行表达，经SDS-PAGE电泳后显示重组融合蛋白在分子量约39ku处有明显表达带，与预期分子量大小一致，且主要以不可溶的包涵体形式存在．变性条件下利用His·Bind树脂成功纯化了融合蛋白，将其免疫家兔，获得兔多克隆抗鲢IL-10抗体，Western blot检测到兔多克隆抗鲢IL-10抗体可有效地与重组蛋白结合．这些结果为进一步研究IL-10的功能奠定了基础．     

中国红豆杉细胞紫杉醇合成期特异表达新基因TS1-FL的部分cDNA克隆

采用mRNA差异显示技术(DDRT—PCR)比较了悬浮培养的中国红豆杉细胞合成紫杉醇前后的基因表达差异,并从紫杉醇合成期细胞中分离出一个特异表达的cDNA克隆TS1．TS1长度为638bp,序列相似性分析结果表明它代表一新基因序列(Genbank登录号：AF426429),将此新基因命名为TS1-FL．开放读框分析结果表明Tsl拥有一个不完整的开放读框,蛋白质同源性检索没有发现与TS1翻译序列有较大同源性的蛋白质．对此基因的进一步研究可揭示它在紫杉醇生物合成中所扮演的角色．     

稻纵卷叶螟一个DELTA家族谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆、序列分析与表达模式

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases ,GSTs）在昆虫代谢各种内源和外源性有害化合物的过程中起关键作用。重要水稻害虫稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）的GST基因目前尚无研究。本实验克隆了一个稻纵卷叶螟delta家族GST基因的全长cDNA序列,命名为CmGSTd3（Genbank登录号KM433686）。CmGSTd3包含681 bp的开放阅读框,编码一个由226个氨基酸组成的蛋白。CmGSTd3蛋白是一个胞质GST ,与已知的昆虫delta家族GST 具有较高的同源性。在系统进化分析中,CmGSTd3与家蚕的delta家族GST聚在同一进化分支上。实时荧光定量PCR结果显示,CmGSTd3基因在稻纵卷叶螟幼虫阶段表达量最高,且主要表达于幼虫的中肠和脂肪体,由此推测其可能参与了体内异源毒物的代谢。本研究为探索CmGSTd3的生理功能奠定了前期基础。     

可用于SRAM PUF的密钥提取方案

为了利用PUF获得芯片唯一、随机的密钥,详细分析可用于SRAM PUF的密钥提取方案,包括采用级联纠错码的硬判决和软判决译码方案。利用芯片上的实际SRAM PUF响应和软件仿真,验证两种方案的效果。结果表明,对于SRAM PUF,软判决方案更加可靠和高效。     

RH株弓形虫抗原及高效价多克隆抗体的制备

通过制备和分析弓形虫抗原蛋白，并以此抗原制备高效价的兔抗弓形虫多克隆抗体，为弓形虫的免疫检测和诊断提供有效的方法和途径，同时也为基因工程产物的鉴定提供方便有效的检测手段．速殖子主要来源于感染后72～74h获得的腹水，通过常规方法制备和提纯弓形虫可溶性抗原，采用SDS-AGE方法分析抗原蛋白的分子量．以抗原和福氏佐剂制备成完全和不完全福氏佐剂通过脊柱两旁皮下多点免疫的途径免疫新西兰大白兔，制备兔抗弓形体多克隆抗体，间接ELISA法检测血清中抗体的效价．经过观察所获得的虫体阶段主要处在宿主细胞巨噬细胞内而尚未逸出阶段，通过对结果的分析，所制备的弓形体抗原的分子量主要集中在17～156ku之间，与文献报道有差异，兔抗弓形体抗体效价在60000以上．该研究结果将为弓形体的蛋白质研究，免疫诊断、预防及有效治疗奠定基础．     

CD40L对B淋巴细胞表面分子及分泌IL-12的影响

在体外使用CD40L作用于B淋巴细胞使之活化,通过测定B淋巴细胞表面分子及分泌细胞因子的变化,探讨B淋巴细胞作为抗原递呈细胞在抗肿瘤免疫中的优势,为B淋巴细胞特异性活化细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)进而发挥其肿瘤细胞杀伤效应奠定基础.取7名健康成人外周静脉血,经淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞(PBMC),分为对照组和实验组,实验组培养液中加入加入CD40L和IL-4,共培养21 d.观察B淋巴细胞生长状况,并在第7 d、第14 d和第21 d,用流式细胞仪(FCAS)测定其表面分子CD80、CD86和CD19,在第21 d,使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养液中的IL-12水平.结果显示,在CD40L的作用下,B淋巴细胞呈克隆样增殖,并高表达表面分子CD80/CD86和CD19,和对照组相比,B淋巴细胞分泌IL-12水平升高(P＜0.05).上述实验结果说明通过CD40L的刺激,B淋巴细胞得到了活化,提示通过该途径活化的B淋巴细胞具备了作为抗原递呈细胞而发挥其抗肿瘤免疫治疗的能力.     

人胰岛素样生长因子-Ⅱ基因cDNA克隆与序列分析

本研究通过RT-PCR技术从人胎盘组织中扩增出长为841bp的胰岛素样生长因子-ⅡcDNA,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在PGEM-T载体的T位点.测序结果和序列分析表明,本人已成功地扩增、克隆了人胰岛素样生长因子-Ⅱ基因cDNA序列.