林可链霉菌噬菌体φSL60启动子的克隆与鉴定

以启动子探针质粒ｐＩＪ４８６为载体,变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３作受体,克隆了林可链霉菌噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ上的启动子活性片段。以ｐＵＣ１８为载体构建ＳＬ６０ＤＮＡ之ＫｐｎＩ片段的基因文库,从中筛选出两个片段,分别克隆于ｐＩＪ４８６中获得ｐＵＩＳ２９和ｐＵＩＳ１９８,在ＭＭ培养基上,两者的转化子对卡那霉素的抗性均仅为１０ｍｇ／Ｌ。噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ的ＢｇｌＩ片段直接克隆入ｐＩＪ４８６的ＢａｍＨＩ位点,获得重组质粒ｐＭＭＳ１,其转化子的卡那霉素抗性在ＭＭ培养基上可达２５０ｍｇ／Ｌ。分析表明ｐＭＭＳ１上的插入片段约为９２０ｂｐ,含有一个ＳｓｔＩ位点,四个ＭｂｏＩ位点。该片段用ＭｂｏＩ部分酶解缩小到６００ｂｐ,亚克隆入ｐＩＪ４８６中得到重组质粒ｐＭＳＢ１４,其转化子对卡那酶素的抗性水平提高到３００ｍｇ／Ｌ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,ｐＭＳＢ１４中的ｎｅｏ基因可以表达出氨基糖苷磷酸转移酶（ＡＰＨＩ蛋白）。这些结果表明ｐＭＳＢ１４中的插入片段可能具有较强的启动子活性。     

大肠杆菌—分枝杆菌启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建

报道了大肠杆菌－分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３的构建过程。证明其保留了在大肠杆菌和分枝杆菌之间的穿梭功能，并具有启动子筛选功能。利用构建的ＰＥＱ３质粒，从卡介苗染色体中筛选出了具启动子活力的ＤＮＡ片段。     

伪狂犬病毒表达载体的构建

利用伪狂犬病毒湖北地方株胸腺核苷激酶基因和ｇＧ糖蛋白基因启动子，构建了ＰＲＶ基因转移载体。通过β－半乳糖苷酶基因确定了ＰｇＧ控制下外源基因的表达并筛选出表达β－半乳糖苷酶的ＰＲＶ重组病毒。     

T7启动子促发下的人尿激酶原在大肠杆菌中的高效表达

将人工全化学合成的尿激酶原（ｐｒｏ－ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＥＴ３ｄ中，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ，经ＩＰＴＧ诱导，获得了占菌体总蛋白１８％的高表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定，表达产物主要为单链尿激酶，并且在菌体内基本以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性，从ＩＬ培养基中可获得３０００００单位的活性尿激酶原。     

虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)组蛋白H3启动子的分子克隆及在稀有

使用高保真PCR方法从虹鳟鱼基因组中克隆得到虹鳟鱼组蛋白H3启动子.将虹鳟鱼组蛋白H3启动子插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建成重组载体pRH3EGFP-1.通过显微注射法得到转pRH3EGFP-1稀有鮈鲫.在荧光解剖镜下,可以清楚地观察到EGFP在发育到原肠胚的转pRH3EGFP-1稀有鮈鲫中表达.在稀有鮈鲫幼体鱼苗中也可以清楚地观察到EGFP在多个组织中的泛组织表达.比较CMV启动子、鲤鱼β-actin启动子、虹鳟鱼组蛋白H3启动子的EGFP表达载体pCMVEGFP,pCAEGFP,pRH3EGFP-1在稀有鮈鲫胚胎中的表达特性,结果表明pCMVEGFP最早表达,其后为pRH3EGFP-1和pCAEGFP,表达的强度依次为pCMVEGFP＞pCAEGFP＞pRH3EGFP-1.这说明虹鳟鱼组蛋白H3启动子可以作为一种有效的启动子,应用于鲤科鱼类(如稀有鮈鲫)的转基因研究.     

痘苗病毒天坛株P7.5k启动子的克隆及其结构与功能的研究

本文利用DNA多聚酶链锁反应(PCR)技术克隆了天坛株痘苗病毒P7.5k启动子,核苷酸序列分析结果表明:天坛株7.5k启动子与WR株7.5k启动子比较,在其155bp中除存在3处点变异外,尚有一段7bp的自然缺失突变,其中4个碱基位于晚期转录起始位点,变异率高达6.45％。然而功能研究结果显示:天坛株和WR株P7.5k均为早晚期启动子,在哺乳动物细胞中两者的启动强度及功能时相均无明显差异。这表明:痘苗病毒基因存在多个转录起始位点是维持其遗传稳定性的一种自身保护机制。     

植物性转基因食品的检测与验证方法

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列，设计并合成了两对不同的引物，建立了PCR-酶切分析-Southern杂交检测并确认转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法．并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测，发现13份样品中有6份检出35S启动子和NOS终止子，7份样品结果为阴性．结果表明建立的检测与验证方法能有效检出转基因作物及其食品中的35S启动子和NOS终止子，具有灵敏度高、特异性好和结果准确的特点，可应用于进出境产品的转基因成分检测．     

一个烟草PR-1a启动子的克隆及序列分析

通过PCR扩增，从烟草Nicotiana tabacum cv Samsun中克隆了水杨酸诱导表达的病程相关蛋白PR-la基因的启动子TP12，以期用于构建诱导表达基因敲除系统，并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。启动子的克隆产物经正反两向测序后，拼接分析结果表明，扩增得到的PR-1α基因启动子长1313个碱基，序列富含AT，其中A T占71．67％，与已报道的序列比较，核苷酸的相似性为98．6％。     

G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控

POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.     

在大肠杆菌中克隆类产碱假单胞菌基因启动子

类产碱假单胞菌 (Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ)是 1991年从重庆歌乐山林场自然病死的黄脊竹蝗(Ｃｅｒａｃｒｉｓｋｉａｎｇｓｕ)中分离到的一种新的病原菌 ,对多种草地蝗虫有较强的感染力[1] .近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白[2 ] 、安全性[3 ] 等方面进行了深入研究 ,证明该菌对蝗虫致病是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致 .该蛋白分子量为 2 5 10 0Ｄａ ,经研究表明 ,该菌无芽孢 ,本身具有较强的毒蛋白 ,故具有构建成为基因工程菌广泛用于生物防治的潜力 .我们采用启动子探针型载体 ｐＳＵＰＶ4 ,分离Ｐ…