真核细胞转录系统启动T7启动子起始的研究

利用氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）和人低密度脂蛋白受体基因（ＬＤＬＲ）作为报道基因,根据α－鹅膏蕈碱（α－ａｍａｎｉｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制,分析Ｔ７噬菌体启动了为哺乳类动物细胞启动外源基因表达的机制。结果表明：真核生物ＲＮＡ聚合酶Ⅱ可启动Ｔ７启动子的转录;同时应用ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动技术,发现人工合成的Ｔ７启动子能与核蛋白质结合,进上步证明了哺乳类动物细胞妄动Ｔ７启动子的转录     

黄牛Sry基因5‘端调控区序列研究

采用聚合酶链式反应技术,以中国湖北雄性黄牛基因组ＤＮＡ为模板,扩增出Ｓｒｙ基因５’端调控区６８０ｂｐ和６４０ｂｐ两个片段,并分别克隆到ｐＵＣ１８上,测序拼接出完整的５’调控序列１０４０ｂｐ,该列含核心启动子和ＡＴＧ起始密码。     

融合表面抗SA-28基因在Pichia Pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原S-preS1融合基因SA-28插入质粒载体pAO815的EcoR Ⅰ位点中,将其置于Pichia Pastoris酵母AOX1启动子控制下.利用电转化技术,融合基因表达单元连同HIS4基因被整合到受体菌SMD1168基因组中.对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明:SA-28基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;SA-28融合基因的表达产物具有S和PreS1的双重抗原性.用CsC1密度梯度离心法纯化了表达产物,融合抗原活性峰位于密度为1.19 mg/cm3的区带.     

杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达

在杂合启动子ＡＤＨ２－ＧＡＰＤＨ控制下于酿酒酵母中表达乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因的过程研究中,确定系统表达的有效阻遏条件为在１０．０ｇ／Ｌ的葡萄糖浓度下进行细胞的预培养,采用稀释操作和碳源饥饿培养等较彻底的支阻遏方式以克服葡萄糖酵解产物阻遏对表达的影响。实验还显示了溶解氧浓度对表达的影响和乙醇流加方式对表达期酵母生长与表达的调节作用。实验获得主培养４５ｈ后湿菌体浓度为１８６ｇ／Ｌ,细胞内ｐ     

嗜盐嗜碱芽孢杆菌NTT76启动子和信号肽序列的克隆及表达

利用启动子信号肽探测型质粒pGPB14,从嗜盐碱芽孢杆菌NTT76的总基因组中克隆具有启动子和信号肽功能的NDA片段,共得到41个转化子,其氨苄青霉素抗性水平在1000－12000mg/L之间,从3个不同抗性不平的转化子中提取重组质粒,酶切显示,外源插入片段在100－500bp之间,将重组粒质转化枯草芽孢杆菌,也同样使枯草芽孢杆菌具有分泌β－丙酰胺酶的功能,β－丙酰胺酶活力测定表明,大肠杆菌产生的酶主要积累在周质空间,而枯草芽孢杆菌产生的酶主要分泌在胞外,对外源插入片段进行定列测定发现,所有片段均含有启动子区、核糖体结合位点和信号肽编码区域。     

转杂色鲍抗冻肽-Ⅲ基因表达载体pIRES2-EGFP-AFP-HdiActinP的构建

现代转基因技术是一种快速改良品种特性的有效方法.采用转基因技术提高我国南方重要贝类经济养殖品种--杂色鲍的耐低温特性是扩大其养殖范围的重要手段.以pIRES2-EGFP为基本载体,以合成并经过功能鉴定的抗冻肽(AFP)和杂色鲍肌动蛋白启动子(HdiActinP)为插入元件,首先用限制性内切酶BamHⅠ和 EcoRⅠ对基本载体pIRES2-EGFP和AFP-Ⅲ进行双酶切,目的酶切产物被回收后再连接得到载体pIRES2-EGFP-AFP.随后利用限制性内切酶SacⅠ和 EcoRⅠ对载体pIRES2-EGFP-AFP和HdiActinP进行双酶切,目的酶切产物被回收后再连接最终得到杂色鲍转AFP-Ⅲ的表达载体pIRES2-EGFP-AFP-HdiActinP,经过聚合酶链式反应和测序验证证明载体构建成功.     

过表达内质网小分子热激蛋白提高拟南芥的衣霉素抗性

内质网小分子热激蛋白是热激蛋白家族成员,具有分子伴侣活性.当植物受到内质网胁迫(ER-stress)时,内质网小分子热激蛋白具有缓解内质网胁迫的功能.我们将CaMV35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因AtHSP22.0导入拟南芥,Northern-blotting印迹分析表明,内质网小分子热激蛋白在转基因拟南芥中呈现组成型表达.转基因株系衣霉素抗性强于对照,说明AtHSP22.0的过量表达增强了拟南芥的衣霉素抗性,缓解了ER-stress.     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

甘蓝型油菜FAE1基因启动子的克隆和瞬时表达载体的构建及功能分析

油菜脂肪酸延长酶基因FAE1是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,根据GenBank上已知的植物FAE1基因启动子序列设计引物,以从甘蓝型油菜(Braccica napus.L)叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1 328 bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列在NCBI进行blast比对,同源性为99.78%,说明该片段与植物中已知的FAE1基因的启动子序列有极高的相似性.将该片段替换掉改造后的pBI221上面的35S启动子从而构建了原生质体瞬时表达载体.然后通过PEG介导的方式将含有FAE1启动子驱动的荧光素酶报告基因(LUC)表达载体导入油菜原生质体中,研究报告基因表达量,证明出脱落酸(ABA)影响了报告基因的表达,随着ABA浓度的不断增加,LUC的表达量呈现逐步下降的趋势.     

野蚕DHPBAN基因启动子的克隆及序列分析

为研究昆虫滞育激素性信息素合成激活肽基因在进化过程中的变化以及基因表达调控的异同,用ＰＣＲ方法克隆了野蚕的ＤＨＰＢＡＮ基因的启动子并测序,这是第二个被克隆的昆虫ＤＨＰＢＡＮ基因启动子．与家蚕相比,在核苷酸水平上同源性达９４％．野蚕ＤＨＰＢＡＮ基因启动子的ＴＡＴＡ框的保守序列为ＴＡＴＡＴＡＡＡ,位于－４７—－４０处;ＣＡＡＴ框是ＧＧＣＣＣＡＴＣＴ,位于－８３—－７５处;野蚕与家蚕一样具有ＴＡＡＴ保守序列,这段序列是一类调控蛋白的结合核心位点,家蚕的位于－１８５—－１７６,野蚕的位于－１７６—－１６７．在－６４—－５６部位,核苷酸序列表现出较大的不同．