四川地区北京型结核分枝杆菌的MIRU-VNTR基因分型

用寡核苷酸多态性基因分型(Spoligotyping)对2008年1月至2010年10月间采集的211株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,然后对北京型结核分枝杆菌VNTR位点的多态性进行检测.选用的12个VNTR位点存在较高的基因多态性,该12位点组合分辨能力(HGI=0.99985)高于标准的VNTR-12位点组合(HGI=0.99546),其中多态性较高的7位点组合HGI指数为0.99977.因此,7位点组合可以作为四川地区北京家族分枝杆菌的一线分型方法.     

VNTR技术用于大理地区结核分枝杆菌基因分型的研究

目的:应用数目可变串联重复序列(VNTR)分子分型技术,对大理地区60株肺结核临床分离株进行分型研究,探讨大理地区菌株DNA多态性及基因型特征。方法:采用VNTR分子分型技术对60株结核分枝杆菌3个VNTR位点进行检测,应用Quantity one软件和BioNumerics 6.6软件进行聚类分析。结果:60株结核分枝杆菌可以分为4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群),28个基因型。Ⅰ群占15.0%,含有5个基因型,Ⅱ群占31.7%,含有8个基因型,Ⅲ群占40.0%,含有11个基因型,Ⅳ群占13.3%,含有4个基因型。结论:大理地区的结核分枝杆菌存在基因多态性,其主要流行群为Ⅲ群。     

四川省结核分枝杆菌基因分型中MIRU VNTR 位点稳定性评价及保守位点分析

本文收集了四川省2009～2013年184株结核分枝杆菌菌株,用标准12 MIRU-VNTR位点组对四川省结核分枝杆菌菌株进行基因分型研究,评估四川地区一线VNTR分型位点的稳定性,确定四川地区保守位点组合及主要MIT型.184株结核分枝杆菌基因分型后得到51个基因型,12个基因型成簇.本研究确定当前四川地区12高分辨力位点VNTR分型方法中的7个MIRU位点依然具有较高的分辩能力（h>055）.MIRU02, MIRU20, MIRU23, MIRU24为多态性最低的4个位点（0 ≤h< 04）,保守位点组的主要MIT型为“2251”.四川省结核分枝杆菌VNTR位点的多态性保持稳定,目前采用的12高分辨力VNTR位点依然稳定可靠.     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

结核分枝杆菌Rv2626c基因的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌Rv2626c基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv2626c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,转化入E.Coli DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后与抗His单抗进行Western-blot,以Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.PCR扩增获得的目的基因为432bp,与预期大小一致,测序与Genebank公布的基因序列完全一致.成功构建原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,转化E.Coli DH5α后能特异性表达目的蛋白,大小约16KD,与理论值相一致.蛋白可溶性分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在,纯化蛋白经Western-blot鉴定有特异性反应条带.成功构建结核分枝杆菌Rv2626c原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,并获得纯化的目的蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础.     

结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合基因稳定转染细胞系的建立

建立可稳定表达结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染P815细胞系. 在阳离子脂质体作用下,将HSP65-hIL-2真核表达质粒转染与BALB/c 遗传背景一致的P815细胞(H-2d).G418筛选阳性克隆,RT-PCR和间接免疫荧光法检测目的蛋白的转录和表达. 阳性克隆细胞经RT-PCR检测到HSP65-hIL-2融合基因特异性的mRNA表达;用鼠抗人的IL-2 mAb进行间接免疫荧光检测,可在转染的P815细胞浆中观察到较强的绿色特异性荧光,而未转染细胞则为阴性.成功获得稳定表达HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染细胞系,为其疫苗的CTL研究提供了合适的靶细胞.     

吉安县2005～2008年结核病例的抗酸杆菌痰涂片镜检分析

目的 了解吉安县结核病抗酸杆菌(AFB)痰涂片检查情况,采取有效措施,提高结核病的发现率.方法 统计分析2005～2008年吉安县结核病AFB痰涂片检查资料.结果 2005～2008年AFB痰涂片镜检共3762例,涂阳肺结核病例981例,总涂阳率为26.1%,涂阳率以15～64岁组最高(31.2%),0～14岁组最低(4.5%)(P＜0.01),男性涂阳率(27.1%)高于女性(23.6%)(χ2=4.965,P＜0.05).县城与乡镇AFB阳性检出率有显著性差异.(χ2=5.147,P＜0.05).结论 吉安县青壮年是AFB痰涂片镜检的重点人群,应加大结防经费的投入,确保乡镇查痰点的建立和正常运转.     

结核分枝杆菌的DNA检测技术及基因组研究进展

全世界每年有３００万死于结核病。ＤＮＡ检测已成为结核分枝杆菌诊断的主要技术地１９９８年结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ的全基因组序列被测定,并发现了修选毒型基因ｅｒｐ,这为人类认识结核分枝杆菌的致病 发子机制和分子诊断开辟了前景。     

MSMEG0372基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

目的 为研究MSMEG＿0372基因的功能,构建该基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)并鉴定。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增MSMEG＿0372基因的左、右臂(即等位基因互换底物,allele exchange substrates, AES)。AES与p0004s经过酶切并连接,构建p0004s-AES质粒。p0004s-AES与phAE159经过酶切并连接,构建phAE159-AES噬菌粒。噬菌粒转化至M.smegmatis,30℃培养,扩增重组噬菌体。用重组噬菌体侵染M.smegmatis,37℃培养,发生基因同源重组,形成MSMEG＿0372基因敲除菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。PCR扩增MSMEG＿0372基因,构建pMV361-MSMEG＿0372质粒。将pMV361-MSMEG＿0372质粒分别导入MSMEG＿0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis,构建MSMEG＿0372基因回补菌株和MSMEG＿0372基因过表达菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。结果 PCR扩增出MSMEG＿0372...     

小鼠结核分枝杆菌感染模型用于评价重组HBHA疫苗免疫效果的实验研究

目的通过复制小鼠结核病模型评价重组HBHA疫苗的免疫效果。方法将重组肝素结合血凝素(HBHA)疫苗接种BALB/c小鼠,观察其诱导的细胞免疫应答水平,并以MTB H37Rv毒株攻击免疫小鼠,研究重组疫苗诱导的保护力。结果重组HBHA免疫BALB/c小鼠后可诱发细胞毒作用,将体内MTB裂解。重组疫苗不仅能刺激CD4+T,CD8+T增殖、活化,还可诱导脾细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子。H37Rv毒株攻击后,被免疫小鼠的组织病理学症状减轻。结论本研究通过检测小鼠体内细胞免疫应答和肺脏组织病理学改变等指标,客观的反映了重组疫苗免疫小鼠结核模型的保护效果。