MSMEG3150调控耻垢分枝杆菌细胞壁的结构与生物膜的形成

目的 探讨耻垢分枝杆菌中MSMEG＿3150蛋白的功能。方法 构建耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150过表达株;采用CRISPRi技术构建耻垢分枝杆菌MSMEG＿3150沉默株。使用MSMEG＿3150过表达株、沉默株和野生型菌株进行实验研究。测定细菌生长曲线;刚果红实验检测细菌表面疏水性。透射电镜、扫描电镜等观察菌体形态、结构。LC-MS测定脂肪酸含量。结晶紫染色定量生物膜形成。结果 过表达MSMEG＿3150导致菌体变长、细胞壁增厚,生长速度加快,脂质含量增多,增强细菌表面的疏水性,促进生物膜形成。结论 MSMEG＿3150可能通过调控耻垢分枝杆菌细胞壁的脂质含量和表面疏水性从而影响细菌的生长特性及生物膜的形成。     

印迹膜测序法分析结核分枝杆菌抗原蛋白

把WesternBlot技术分析抗原抗体反应的高度特异性与用PVDF膜作载体进行蛋白质氨基酸序列分析的高度敏感性相结合对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,TB)的特异性、保护性抗原进行筛选和分析鉴定 ,获得了分子量为 31KDa、30KDa的抗原 这两种抗原与抗结核分枝杆菌的单克隆抗体和结核病人血清均发生阳性反应 ,而与正常小鼠血清和健康人血清呈阴性反应 用印迹膜测序法测出 31KDa抗原蛋白的N 末端序列为AlaGluValAspTrpLeuValPheAlaValSerTrpProValGly ,30KDa蛋白序列为PheSerArgProGlyLeuProValGluTry 印迹膜测序为分子生物学研究提供了一种有效的新途径     

胶体金免疫层析法在结核病快速诊断中的应用

目的:探讨用胶体金免疫层析法检测血清及胸水中结核抗体,评估其在结核病快速诊断试验的相关指标。方法:应用免疫层析技术来检测血清及胸水中的结核抗体。检测临床诊断肺结核患者112例(其中分菌阳组、菌阴组)和96例无结核病史的健康体检者的血清结核抗体水平;52例结核性胸膜患者胸水中的结核抗体水平,同时对胸水进行抗酸染色镜检。计算诊断试验的相关指标。结果:该检测方法临床诊断肺结核的敏感性为60.7%,特异性为95.83%,准确性为79.2%,诊断指数为156.53%,阳性预期值为94.44%,阴性预期值为67.6%;胸水中结核抗体阳性22例,敏感性为42%,胸水结核抗体阳性率和胸水抗酸染色阳性率结果有显著性差异p(0.05。结论:血清结核抗体检测具有较高的敏感性和特异性,可用于临床肺结核的辅助诊断,对评价肺结核的疗效有较高的实用价值。胸水中结核抗体检测对结核性胸膜炎的诊断也具有重要的临床参考价值。     

气相色谱法用于分枝杆菌脂肪酸组成与菌种鉴定的研究

采用非极性毛细管柱气相色谱法对３株分枝杆菌细胞脂肪酸化学组成进行了研究,得到特异性指纹识别图,并对７例临床分离的分枝杆菌进行了鉴别。结果表明,结核菌硬脂酸（ＴＳＡ）为分枝杆菌属的特征组分,其含量与其他中长链脂肪酸的百分组成随菌种不同而异。     

基于分枝菌酸的分枝杆菌反相高效液相色谱分型鉴定方法

采用反相高效液相色谱法(HPLC)构建了49种分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹图谱库,并对分枝杆菌进行分型鉴定。菌株经培养(对于慢生长分枝杆菌培养3周,快生长分枝杆菌培养1周)后,取两植菌勺的量,皂化1 h后,于4 ℃下储存。通过酸化方法提取分枝菌酸,并用4-溴苯甲酰基溴衍生化,以HPLC分析分枝杆菌衍生物,并以其峰形的分布及峰的相对保留时间、相对峰高为指标对分枝杆菌进行分型鉴定。该法重现性良好,各峰保留时间的相对标准偏差为0.13%～1.07%。根据构建的49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株的分枝菌酸指纹谱库,发现不同菌种的分枝菌酸的指纹图谱分别具有单簇峰、双簇峰、三簇峰(含多簇峰)的特征。依据相对保留时间和相对峰高的不同,对49种分枝杆菌中的41种进行了分型。结果表明,所建立的反相HPLC法可快速准确地对分枝杆菌进行分型鉴定。     

尘肺结核患者Mycobacterium tuberculosis耐药基因突变研究

研究尘肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药基因突变与耐药性的关系。在97例尘肺结核患者痰中检出MTB菌株28株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因突变,并与采用常规药敏试验(AST)法检测的耐药结果进行对比分析。采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因,突变率分别为42.86%(12/28)、42.86%(12/28)和32.14%(9/28),采用AST法检测INH、RFP和SM,耐药率分别为64.23%(18/28)、60.71%(17/28)和53.57%(15/28),两者之间差异均无显著性(P>0.05)。其中多耐药株20例(71.43%),包括耐三种药物12例(42.86%),耐两种药8例(28.57%),单耐药株6例(21.43%),敏感株2例,耐药率92.86%。PCR-SSCP法检出3个基因联合突变8株,与AST法符合率为66.67%(8/12);2个基因突变5株,符合率为62.50%(5/8);单基因突变2株,符合率为33.33%(2/6)。结果表明:PCR-SSCP技术适用于MTB katG、rpoB和rpsL耐药基因突变的筛选,对指导尘肺结核患者临床用药上具有重要意义。     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B—ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815（H-2^4）细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过RT-PCR检测到该细胞中有Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。     

结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达质粒的构建及表达

构建结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达载体.PCR扩增Rv2450基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA-Rv2450,RT-PCR结果证明Rv2450可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv2450蛋白的细胞着染.成功构建了结核分枝杆菌Rv2450基因的真核表达载体pCDNA-Rv2450,Rv2450基因可以在P815细胞中表达.     

西安地区耐利福平结核杆菌rpoB基因突变特点

目的 阐明结核分枝杆茵耐利福平菌株rpoB基因的突变特征.方法 对包含81bp的利福平抗药性决定区(rifampicin-resistance determining region,RRDR)的30株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的PCR产物进行测序分析.结果 18株耐利福平菌株中,除一株发生了513,514位密码子的缺失突变外,其他菌株均发生了单核甘酸替换(单点突变),并且这些突变均发生在rpoB基因的RRDR区内.其中531,526,516位密码子的突变率分别为44.4%,27.8%,16.7%,它们之和为88.9%;12株利福平敏感株中有3株检出了与耐药性有关的基因突变.结论 西安地区结核分枝杆菌耐利福平菌株rpoB基因突变以点突变为主,缺失突变则比较少见.最为常见的突变分别位于531位、526位和516位密码子,其中531位密码子的突变率同其他位相比占有明显优势,且531住TCG→TTG突变在rpoB基因所有突变类型中具有最高的突变频率.     

肺外感染的非结核分枝杆菌

从非结核分枝杆菌的储存处、水的传染源作用介绍了国内外非结核分枝杆菌的栖息地与传染源;从淋巴结炎与鸟分枝杆菌、淋巴结炎与嗜血分枝杆菌和身体其它部位感染等方面阐述了肺外感染与非结核分枝杆菌的关系;在例举国内NTM医院感染暴发的基础上总结了NTM的毒力因子.