马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

人尿激酶原在CHO细胞中的基因扩增与高效表达

本文通过基因共转染和基因共扩增方法,在SV40病毒晚期启动子控制下成功地在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-DHFR~-)中高效表达了人尿激酶原,其表达水平在5×10~(-6) mol/L氨甲喋呤存在下可达2—3μg/10~6细胞/24 h。采用PMA诱导可将表达水平提高至3.5—4μg/10~6细胞/24 h。相应的Pro-UKcDNA在细胞基因组上整合的拷贝数为200—300拷贝/细胞。Western blot分析表明,表达出来的重组Pro-UK与天然Pro-UK具有相似的分子量:S_(2444)测活法证明重组Pro-UK具有体外酰胺水解活性。     

冬小麦春化作用相关基因的cDNA分子克隆研究

以春化处理冬小麦幼苗cDNA为起始材料,通过与对照冬小麦幼苗mRNA进行减法杂交构建富集冬小麦低温诱导cDNA文库,以对照和脱春化幼苗cDNA及春化幼苗cDNA为探针,采用差异杂交技术筛选得到春化相关cDNA克隆,将插入片段用PCR方法扩增后亚克隆于pUC19载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,用此插入cDNA作探针,与对照和春化组mRNA作Northern blotting分析表明为冬小麦春化作用相关基因的cDNA克隆,包含verc203序列的mRNA大约为2.6kb。     

人体β-珠蛋白基因5′-旁侧DNA序列内的负调控区域1(NCR1)与HMG蛋白质(1+2)的相互作用

利用分子生物学技术和扫描隧道显微镜方法首次观察到HMG蛋白质(1+2)和人体β-珠蛋白基因的5′-旁侧DNA序列内的一个负调控区域(NCR1)相互作用的构象,这类蛋白质能将线状的DNA片段(～200bp)折叠起来,形成一个环状结构(直径70±6A)和°一条似乎呈现左手螺旋(z-from)的线状DNA尾巴。     

错配杂交化学发光法检测细胞色素P4501A1基因多态性

建立一种检测细胞色素P4501A1基因多态性的新方法。针对每个多态位点设计两根寡核苷酸探针，两根探针的区别仅在于突变位点处一个碱基。每个样品分别与两根探针进行杂交，采用化学发光法检测杂交体，通过两根探针的杂交信号强度之比确定基因型。与参考方法比较，该法具有快速、简便、费用低廉等优点。     

丝心蛋白基因分子克隆与表达的初步探讨

通过聚合酶链反应扩增丝心蛋白Ｃ亚基结构的基因，并将基克隆到融合蛋白表达载体ｐＲＩＴ２Ｔ质粒中得到ｐＲＩＴ２Ｔ－ＦＬ质粒，在大肠杆菌株Ｐ２３９２内进行表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹反应证明融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

聚合酶链反应用于高效的基因改造

本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99％以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。     

人体基因组课题（HGP）计划给分析化学带来的挑战与机会

本文综述了在ＤＮＡ测序方面分析化学的最新进展，包括电泳，毛细管电泳（ＣＥ），质谱（ＭＳ），电喷雾电离－质谱（ＥＳＩ－ＭＳ），荧光光谱、共振离子谱（ＲＩＳ）和单分子测定，同时还叙述了两维技术和多段测序方法的进展。