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Dr. Delilah Jewel Dr. Rachel E. Kelemen Rachel L. Huang Dr. Zeyu Zhu Bharathi Sundaresh Kaitlin Malley Quan Pham Conor Loynd Zeyi Huang Prof. Tim van Opijnen Prof. Abhishek Chatterjee 《Angewandte Chemie (Weinheim an der Bergstrasse, Germany)》2024,136(9):e202316428
Heterologous tRNAs used for noncanonical amino acid (ncAA) mutagenesis in mammalian cells typically show poor activity. We recently introduced a virus-assisted directed evolution strategy (VADER) that can enrich improved tRNA mutants from naïve libraries in mammalian cells. However, VADER was limited to processing only a few thousand mutants; the inability to screen a larger sequence space precluded the identification of highly active variants with distal synergistic mutations. Here, we report VADER2.0, which can process significantly larger mutant libraries. It also employs a novel library design, which maintains base-pairing between distant residues in the stem regions, allowing us to pack a higher density of functional mutants within a fixed sequence space. VADER2.0 enabled simultaneous engineering of the entire acceptor stem of M. mazei pyrrolysyl tRNA (tRNAPyl), leading to a remarkably improved variant, which facilitates more efficient incorporation of a wider range of ncAAs, and enables facile development of viral vectors and stable cell-lines for ncAA mutagenesis. 相似文献