激光波长对荧光激发谱分布影响研究

激光器是DNA测序仪中的重要部件,寻求合适波长的激光器可有效提高DNA测序仪性能。分析了DNA检测所用的四种荧光染料FAM、JOE、TAMRA和ROX的激发谱和发射谱,设计实验技术方案利用488nm、505nm和515nm三种不同波长的激光器分别对其进行激发。在相同的积分时间和相同的功率下,488nm激光器对于荧光染料ROX的激发强度太低,515nm激光器对于荧光染料FAM的激发强度太低,而505nm激光器对于四种荧光染料的激发强度均比较强。实验结果表明在三种不同波长中,505nm激光器对四种荧光染料的激发效果最佳,可以替代目前大多数DNA测序仪中的氩离子激光器。     

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。     

人类基因组初期计划的结束--新的起点

最近的Nature杂志发表了一篇文章，宣告人类基因组常染色体测序的结束．渎者可能会产生疑问，人类基因组计划不是三年前就宣告结束了吗，这再一次的宣告结束是什么意思？其实，三年前结束的只是人类基因组的草图，草图留下了许多的缺憾．比如，在“常染色体”的部分（基因组富含基因的部分）碱基对缺失了10％．这已经不是个小数目，而整个基因组的碱基对则缺失了30％．当时的草图含有成千上万的间隙（未能测得碱基对顺序的区间）和被错误放置的区域。     

基于克隆测序技术的人类白细胞抗原基因高分辨率分型方法的建立

运用优化的扩增和克隆测序技术,建立了人类白细胞抗原( HLA-B)基因的高分辨率分型方法。针对HLA-B基因保守区序列设计引物进行等位基因扩增,基于质粒不相容原理将杂合型等位基因有效克隆入质粒DNA中,经细菌培养后进行Sanger测序,根据测序结果经ClustalX2软件分析和IMTG/HLA数据库的BLAST比对即可完成HLA-B基因的高分辨率分型。利用建立的方法对7例临床样本进行了HLA-B基因分型,并且与第三方直接碱基序列分析基因分型技术( PCR-SBT)进行比对,结果完全一致。本方法无需专业分型软件,准确度高,成本低;采用通用引物进行等位基因的扩增和测序,无需传统方法中繁琐的引物设计和过程优化,实现了HLA-B基因的高分辨率分型。     

诺贝尔化学奖知多少——历届诺贝尔化学奖小统计

<正>1895年11月27日,诺贝尔(Alfred Nobel)签署了关于他生前财产处理的遗嘱,用其财产的大部分设立一个系列奖:诺贝尔奖。在遗嘱中他写道:其中的一部分用来奖励致力于做出了"最重要的化学发明或改进的人"。下面介绍一些有关1901至2014年诺贝尔化学奖的小统计。迄今颁发过多少次诺贝尔化学奖?1901年以来,共颁发了106次化学奖。其间,1916,1917,1919,1924,1933,1940,1941     

DNA中醛基嘧啶的化学检测

基因组DNA除A、G、T、C四大经典碱基外,还存在上百种稀有碱基。其中,醛基嘧啶(5-醛基胞嘧啶和5-醛基尿嘧啶)是DNA中天然存在的嘧啶类修饰碱基,在哺乳动物细胞中广泛分布。5-醛基胞嘧啶除参与DNA主动去甲基化过程外,还具备独立的表观遗传功能;而5-醛基尿嘧啶通常被认为是一种基因毒性很高的DNA氧化损伤。根据醛基嘧啶的特征结构,有针对性地开发准确、灵敏和简便的检测方法,从全基因组范围内对他们进行定性、定量和区域定位,是进一步明确这类碱基修饰物调控机制的基础和前提。本文从选择性化学标记的角度总结了近年来醛基嘧啶检测方法的研究进展。     

焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计

利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时,测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此,PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例,通过设计具有不同多聚酶亲和指数(PPI)的PCR引物,并运用焦磷酸测序测定其扩增产物,考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响;以rs914232、rs671位点为例,对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序,考察了两者对测序结果的影响。结果表明,提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度,测序方向和dNTP推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此,在设计PCR引物时,应将多聚酶亲和指数理论与传统基于解链温度值的引物设计思路相结合,为焦磷酸测序提供高质量的测序模板;在进行定量测序时,还要综合考虑待测位点(SNP)两侧的序列,选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序,使测序结果更加准确。     

允许长度估计误差的SBH最优重构问题及其算法

本文讨论了允许长度估计误差和杂交错误的更实际SBH(Sequencing by Hybridization)最优重构问题.通过对SBH谱集中k-tuple之间的相关信息的分析和最优重构性质的讨论,我们得到若干非最优解的删除法则和最优解的判定法则,并获得了一个能够极大地减少最优解重构随意性的动态规划计算方法.由此,我们给出了该SBH问题的一个新重构算法.该算法既允许SBH谱集含有一般杂交实验中可能出现的探针错配所产生的正错误,也允许目标DNA序列长度有估计误差,所以本文的算法具有更一般的适应性和实用性.模拟计算结果表明我们的算法也是十分有效的(即使在谱集有多达100%的正错误情况).     

互补多酶解法在蛋白质C末端质谱检测中的应用

建立了互补型多酶解法与串联质谱联用鉴定蛋白C末端技术.在大量蛋白的实际检测中,根据蛋白序列分别采用溴化氰、胰蛋白酶、谷氨酸内切酶和糜蛋白酶进行酶解或混合酶解.利用此技术对8个蛋白不同长度的C末端肽段(分子量分布在200～3000 Da之间,目的肽段分别为m/z 272.20,788.45,796.48,944.58,1...     

一种基于SU8聚合物的基因测序芯片

基因测序技术极大地推动了生物学和医学研究的发展. 结合了焦磷酸测序 原理及阵列式微反应池芯片的高通量测序仪在从头测序和宏基因组测序方面有着不可替代的作用. 本文首次提出并研制了一种基于SU8聚合物的基因测序芯片. 选择了高传输效率、 低耦合损耗的光纤面板作为基片, 通过改善SU8均匀性及释放应力, 在光纤面板上成功制备出百万数量级阵列式微反应池; 设计并制作侧壁镀膜装置, 实现了SU8阵列式微反应池侧壁选择性光学薄膜蒸镀, 有效地提高了微反应池的光学隔离度, 将相邻微反应池之间的光串扰率平均值从25%降低到了1%, 满足了高通量焦磷酸测序对测序芯片独立并行传输弱光信号的要求. 基于SU8聚合物的基因测序芯片制备工艺简单、成本低廉, 具有良好的应用前景. 关键词： DNA测序 SU8 微反应池 光纤面板