嗜盐细菌冷冻干燥保护剂的正交法优化

报道了利用正交试验设计的原理和方法，筛选冷冻干燥保藏盐生盐杆菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｂｉｕｍ）菌株Ｒ１的保护剂组成与最佳配比的结果．直接分析和方差分析的结果表明：在由ＮａＣｌ、水解乳蛋白、海藻糖和蔗糖４种成份组成的保护剂系统中，海藻糖对菌株Ｒ１冷冻干燥存活率影响最大，为主要因素；其次为蔗糖和ＮａＣｌ；水解乳蛋白影响最小，为次要因素．保护剂最优的水平组合为ＮａＣｌ１６％、水解乳蛋白４％、海藻糖６％、蔗糖１８％．采用正交法从传统“简单可比性”需８１次的实验减少到９次，并且正交法的综合可比性能在较短时间内找出最佳的水平组合．利用最佳组合的保护剂使冷冻干燥菌株Ｒ１存活率达到９１．８０％．从试验的结果可以认为只要选择适当的保护剂，用冷冻干燥法保藏嗜盐菌是安全可行的．     

多方法组合分析脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠和重折叠过程的构象转化

以变性和非变性电泳、体积排阻色谱、内源荧光发射光谱、荧光相图、荧光猝灭以及活性测定等组合分析方法,研究了脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程。结果表明,在脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中,芽孢杆菌α-淀粉酶分子始终以单分子形式存在,不会形成分子间的聚集体或聚集体沉淀。当变性液或复性液中脲浓度约为4.0mol/L时,芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中均出现一个部分折叠中间体,两个过程均符合"三态模型"。脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子重折叠过程的复性曲线几乎与芽孢杆菌α-淀粉酶分子去折叠过程的残余活性率曲线重合。通过这些结果,并结合盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程,推断脲和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程分别是相互可逆的。     

利用微生物本身的PHAs解聚酶生产羟基丁酸单体

金黄芽孢杆菌Bacillus aureus JMα5先在糖蜜上发酵积累聚羟基丁酸酯（PHB）,然后在限氧条件下降解生成手性羟基丁酸（HB）分子。研究各种培养条件如pH值、温度、时间等对该菌降解生产手性HB分子的影响。结果表明,37℃下,当pH=6时,10h内,HB单体的产量可达3．04g/L,降解率为75％,说明采用酶降解法生产HB单体具有一定的实际应用价值。在各种影响因素（包括降解体系的pH值、降解的温度和降解时间等）中,pH值对降解率的影响最大。     

根癌农杆菌的高效电激转化

利用电激法将双元载体质粒ＰＢＩ１２１导入根癌农杆菌ＡＧＬ－１并获得较高转化效率．探讨了不同电激条件对转化效率的影响，并检测了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中的表达．结果表明：根癌农杆菌电激转化的最适电激条件为１１ｋＶ／ｃｍ，２１．５μＦ，电场强度是影响转化效率的关键因素．当质粒ＤＮＡ浓度从０．２ｍｇ／Ｌ增加至０．６ｍｇ／Ｌ时，转化效率呈线性增加．细菌密度对转化效率也有一定影响．最高转化效率为每μｇ质粒ＤＮＡ１．７×１０５转化子．组织化学反应证实ＣａＭＶ３５Ｓ能启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中表达．     

高效液相色谱法测定发酵液中杆菌肽A

提出了高效液相色谱法测定发酵液中杆菌肽A含量的方法。地衣芽孢杆菌发酵液经离心得到杆菌肽A的粗提液。所得粗提液再经三氯乙酸提取,离心分离。取上清液用Beckman C18色谱柱分离,用乙腈和磷酸二氢钾缓冲溶液以不同体积比混合为流动相梯度洗脱,在220 nm波长处进行测定。杆菌肽A的质量浓度在1.0~15.0 g·L-1范围内与其峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)为0.08 g·L-1。在7.37 g·L-1和11.01 g·L-1两个添加水平做回收试验,平均回收率分别为98.1%和97.4%。     

高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中粘杆菌素、多粘菌素B的残留量

建立了动物源食品中粘杆菌素和多粘菌素B残留的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定方法。样品用V(10%三氯乙酸水溶液):V(乙腈)=30:70提取,Oasis WCX SPE柱净化,LC-MS/MS电喷雾正离子多反应监测模式(ESI+-MRM)检测。分析物在0～250μg/kg的浓度范围内呈良好线性,线性相关系数>0.995。方法的定量限为10μg/kg。方法在三个添加水平的平均回收率在71.6%～78.9%之间,相对标准偏差在6.2%～12%之间。方法适用于动物源食品中粘杆菌素和多粘菌素B的定量及确证检测。     

转基因红豆草植株的再生

红豆草子叶外植体能被含非致瘤性的Ti质粒的根癌农杆菌感染.该载体质粒含一个npt-Ⅱ基因和一个胭脂碱合成酶基因.对卡那霉素抗性植株的胭脂碱检测、NPT-Ⅱ酶活性测定和DNA分子杂交试验表明,外源的npt-Ⅱ基因和胭脂碱合成酶基因已导入了红豆草细胞并能在植株水平表达相应的性状.     

来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因的合成与融合表达

将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换, 利用化学和基于聚合酶链反应(PCR)技术的酶促方法进行基因全合成, 利用pET-32a构建重组表达载体pET-dan, 转化进E.coil BL21(DE3)中进行融合表达. 经SDS-PAGE电泳、 Western-blot检测和活性测定发现, D-ANase可在大肠杆菌中高效表达, 目的蛋白可达到菌体总蛋白的69.2%, 密码子优化后基因构建的工程菌发酵活性为96 U/mL, 重组蛋白经超声细胞破碎及Ni²⁺柱亲和层析纯化, 比活可达1692.3 U/mg, 纯度可达95%以上.     

Ca2+诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的生物活性和结构变化

在研究Ca²⁺对淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子生物活性影响的基础上, 采用荧光光谱法和傅里叶变换红外光谱法研究了Ca²⁺诱导的酶分子结构变化. 结果表明, 当溶液中Ca²⁺浓度低于25.0 mmol/L时, Ca²⁺对酶分子具有激活作用; 而当Ca²⁺浓度高于25.0 mmol/L时, Ca²⁺对酶分子的生物活性具有抑制作用. 在Ca²⁺诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子结构变化过程中, 酶分子仅发生二级结构的变化, 并不涉及其三级结构. 当Ca²⁺对酶分子具有激活作用时, 酶分子中的无规卷曲结构及β-折叠结构的含量下降, 而α-螺旋结构及β-转角结构的含量上升; 而当Ca²⁺对酶分子生物活性具有抑制作用时, 酶分子中的α-螺旋结构及β-转角结构的含量下降, 而无规卷曲结构及β-折叠结构的含量上升.     

以葛根素为辣根过氧化物酶底物的新体系及其分析应用

以一种天然活性成分葛根素(Puerarin)为辣根过氧化物酶(HRP)底物建立了葛根素-辣根过氧化物酶-过氧化氢反应新体系. 在反应体系中 HRP 催化H₂O₂ 氧化葛根素(弱荧光)形成二聚体产物(强荧光), 该产物在315 nm 的激发光下能发射波长为478 nm的强荧光, 并且反应体系荧光强度增加与HRP量在一定浓度范围内呈线性相关. 根据此关系和竞争型免疫定量原理, 以兔布氏杆菌抗体为分析对象建立了基于葛根素的酶联荧光免疫传感分析新方法. 对葛根素性质的研究结果证实, 葛根素在空气中稳定、对温度稳定, 对H₂O₂＋HRP 敏感性优于传统底物如对羟基苯乙酸、Amplex Red和高香草酸. 优化了酶联荧光免疫传感分析方法的实验条件如HRP-BrAb 用量、温度等. 运用新体系测定了兔血清样品的布氏杆菌抗体, 该方法线性范围为1.3～120 ng/mL, 检测限为1.3 ng/mL (3σ), 相对标准偏差为3.8%.