温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８,构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５,该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签,利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点,构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连,利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱,对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化, 其纯度超过 ８０％ ;对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化,产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 型标准阳性血清发生较强的免疫学反应     

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９,成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座,获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ）,在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ为杆状病毒ＢａｃｔｏＢａｃ策略增添了一个新成员     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

B组轮状病毒WH-1株nsp2基因的原核表达与抗体制备

根据B组轮状病毒(GBRV)WH-1株nsp2基因的全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到nsp2基因的编码区.将其片段克隆到原核表达载体pGEX-KG上,经IPTG诱导,在E.coliDH5α菌株中得到高效表达.表达的GST融合蛋白大小为61×103,经SDS-PAGE分离纯化,免疫小白鼠制备了多克隆抗体.抗体经1∶3 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号.所表达的蛋白和制备的抗体可用于蛋白结构和功能的进一步研究.     

海藻酸钠/大豆蛋白共混凝胶微球的结构

利用钙离子交联海藻酸钠／大豆分离蛋白共混溶液，制得海藻酸钠／大豆分离蛋共混凝胶微球．结果表明，海藻酸钠和大豆分离蛋白质量配比的不同以及各组分间相互作用的变化，微球呈现不同的微观结构．将微球干燥后置于水中溶胀，微球的尺寸无法回复到干燥前的尺寸，这是由于真空干燥处理使水分子挥发，促进微球内组分间形成了强的氢键作用所致．此外，用碱处理该共混微球，发现由于大豆分离蛋白溶解以及部分钙离子被置换析出，微球塌陷且内部形成了大孔．     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白β亚基的体内重组

为研究藻蓝蛋白β亚基的生物合成途径，通过构建相容的3种重组质粒pET—cpcB（C155Ⅰ）、pCDFDuet—cpeS和pACYCDuet—hol—pcyA，将裂合酶基因cpeS、血红素氧化酶基因hol、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和藻监蛋白β脱辅基蛋白基因cpcB（C155Ⅰ）共同转入大肠杆菌．通过色素蛋白锌电泳和光谱检测，结果表明产生了有生物活性的CpcB（C155Ⅰ）-PCB．而在裂合酶基因cpeS不转入大肠杆菌的情况下，大肠杆菌内只有7．6％的CpcB（C155Ⅰ）-PCB产生．实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白β亚基84位半胱氨酸残基与PCB连接，为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础．     

柞蚕丝蛋白中酪氨酸分布的电子光谱研究

柞蚕丝和桑蚕丝均系由18种氨基酸组成的丝蛋白,但二者的性质差异较大。搞清酪氨酸在丝蛋白中的分布,涉及蛋白一级结构,才能有助于找出柞蚕丝与桑蚕丝性质差异的原因。为此我们研究了酪氨酸的分布。本文采用分级水解的方法,对柞蚕丝进行水解,测定各次水解液的紫外和荧光光谱,考察芳香氨基酸(指酪氨酸)在柞蚕丝中的分布。结果发现其分布呈“W”型。     

抗生物素蛋白与DNA相互作用的单分子研究

抗生物素蛋白(avidin)在生物单分子实验中被广泛用于DNA与修饰表面的连接,同时avidin也可作为一种DNA载体用于基因治疗中.本文利用原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、单分子磁镊(MT)技术系统地研究了avidin与DNA之间的相互作用,以及avidin引起DNA凝聚的机理.首先通过AFM对avidin-DNA复合体形貌进行观察,发现不但有avidin导致DNA凝聚的环状形貌,同时也存在avidin自身聚集引起的DNA凝聚现象,通过定量分析,发现其凝聚尺寸越来越小,而当avidin浓度大于2 ng·μL~(-1)时,其凝聚尺寸又突然变大.DLS实验结果也显示了同样的规律,伴随着avidin浓度的升高,DNA的粒径大小从大约170 nm减小到125 nm左右,其电泳迁移率由-2.76(10~(-4)cm~2·V~(-1)·s~(-1))变化到-0.1(10~(-4)cm~2·V~(-1)·~(-1)).此外,通过MT技术的力谱曲线变化,发现avidin导致的DNA凝聚与其他多价离子相比,长度的变化曲线几乎呈线性变化,偶尔存在少而小的阶跃,这种变化趋势与组蛋白的变化曲线更相似.因此可以判断,avidin导致DNA凝聚是由avidin与DNA的静电吸引和avidin自身聚集两种相互作用引起的.     

驱动蛋白力产生机制的研究

驱动蛋白颈链对接过程及其力产生机制的研究,是揭示驱动蛋白结构与功能的关系,认识 生物体蛋白质中普遍存在的、高效的能量转化机制和精确的构象变化调控机制的一个基础性课 题。本文中,我们对驱动蛋白颈链对接的过程及其力产生机制进行了系统地分析研究。通过分子 动力学模拟,得到了处于空态的马达头部的合理结构。在此结构的基础上,通过对颈链对接的启 动机制以及具体实现过程、ATP结合引起的马达头部转动到颈链对接过程力传递路径的分析,从 动力学上实现了驱动蛋白颈链对接;澄清了颈链对接的启动机制、颈链向马达头部对接的实现机 制、驱动蛋白向前行走时的力产生机制、以及驱动蛋白双头力学化学循环调控机制。对文中所讨 论的一些关键问题,给出了实验验证的可能方案。本文的研究结果对理解驱动蛋白结构与功能关 系、分子马达的力产生机制、做功原理和高效的能量转换机制有重要的参考价值。     

用光来操纵活性生物分子

 现在展示在你面前的照片是一个红血球细胞(图1上)以及它被拉伸而变形的情形(图1下)。这是奥斯汀德克萨斯大学的一个研究组进行的研究细胞弹性的实验。他们用激光作工具,利用光进入细胞时产生的对细胞的作用力使细胞拉长,拉伸程度与激光的强度有关。由于细胞被癌病侵害后其弹性会发生改变,用这个办法能够筛选出有病细胞的数量。德克萨斯大学的这个实验也成功地证明了,如果一束激光照到一个完整的生物细胞上,在光进入细胞时对细胞有一个与进入方向相反的作用力,在光射出细胞时对细胞有一个与射出方向相同的作用力。那么这力是怎样产生的呢?其原理实际上并不很深奥。