大肠杆菌DNA和RNA中核苷的高效液相色谱分析

建立了用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定大肠杆菌（E.coli）脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）水解产物中核苷的方法，色谱柱为Supelco Inc.c18反相柱，254nm和280nm紫外吸收波长同时检测，分析条件经选择在流速为1mL/min，流动相A（2.5%甲醇 0.01mol/L KH2PO4,PH4.6)28min，流动相B（8.0%甲醇 0.01mol/L KH2PO4，PH4.6)37min，柱温为20℃条件下65min可实现核苷的完全分离，回收率为80.19%-99.31%，相对标准偏差RSD为0.86%-2.62%，该方法具有高灵敏度、高选择性的特点，得到的结果与十分满意。     

酵母核糖核酸的UV-Vis光谱探针反应的机理研究

采用UV－Vis分光光度法，研究在pH7－8的缓冲溶液中，酵母核糖核酸（RNA）与3－氨基－6－二甲氨基－2－甲基吩嗪盐酸盐（ZR）相互作用；反应生成红色配合物，该配合物的最大吸收波长为540nm；反应前后的吸收光谱变化明显，配合物的吸收峰与试剂本身比较红移90nm；研究了体系的酸度、温度、时间等基本反应条件以及不同类型的离子对体系的影响，发现离子强度的改变对体系的吸光度有明显的影响。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及烷基糖苷的催化合成

将来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus NO. F-50)的β-葡萄糖苷酶Ⅰ在毕赤酵母中分泌表达. 初步研究表明, 目的蛋白得到较好表达, 以对硝基酚-β-D-葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, pNPG)为底物, 重组β-葡萄糖苷酶Ⅰ酶促反应的最适温度为65 ℃, 最适pH为5.0, 50 ℃下反应发酵上清液中的酶活力可达33.8 U/mL, 蛋白表达量最高可达0.388 mg/mL. 该重组酶可通过逆水解或转糖苷反应催化合成烷基糖苷. 在有机-水双相反应体系中, 初步优化了pH 值、 含水量、 葡萄糖浓度及酶量等条件. 结果表明, 在优化的反应条件下, 丁基、 己基、 辛基和癸基葡萄糖苷最大产率分别为51.4%, 28.8%, 6.9%和3.0%.     

RT-PCR和RNA干扰方法用于检测卵巢癌iASPP基因的研究

用实时荧光定量PCR方法检测56对人卵巢癌组织及对应的癌旁组织中iASPP(Inhibitor of ASPP fami-ly)mRNA表达水平,应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析癌组织与癌旁组织中iASPP mRNA表达水平,探索iASPP在卵巢癌发生中的作用。从细胞水平进一步研究其作用机制,用siRNA干扰的方法使iASPP表达降低后用Hoechst 33342和CCK-8分别检测iASPP沉默后对人类卵巢癌细胞株OVCA420的影响。结果显示,卵巢癌组织中iASPP表达较癌旁组织明显增高;iASPP沉默后,细胞凋亡增多,细胞增殖水平降低。据此推断,iASPP mRNA水平对卵巢癌的临床诊断具有一定价值,可作为卵巢癌治疗的一个重要靶点。     

高效液相色谱法测定克鲁维酵母菊芋发酵液中的乙醇,糖和有机酸类代谢成分

建立了高效液相色谱法同时分析菊芋发酵液中的乙醇和有机酸的方法.采用HPLC有机酸分析柱, 流动相为0.01 mol/L H2SO4,流速为0.5 mL/min, 以紫外和示差折光检测器作为双通道检测手段,同时对克鲁维酵母菊芋发酵液中的柠檬酸、α-酮戊二酸、葡萄糖、丙酮酸、果糖、琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、乙醇进行了定量分析,本方法的回收率为95.8%～109.6%;RSD为0.33%～4.0%,结果表明,本方法简单、快速、准确,适用于监控克鲁维酵母发酵产物并指导整个发酵过程条件的优化.     

双水相萃取-高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量

建立了乙醇-水双水相萃取-高效液相色谱法测定酵母细胞中麦角固醇含量的分析方法。先使酵母细胞在KOH-乙醇溶液中于85℃~90℃回流皂化2 h,冷却后加入适量分相剂Na3PO4.12H2O使其形成双水相体系,经振摇萃取,麦角固醇进入乙醇相,萃取效率为95%~102%。用高效液相色谱法(HPLC)测定醇相中麦角固醇含量,采用DiamonsilTMC18色谱柱(200×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇,流速为1.0 mL/min;紫外检测波长为281 nm,进样量为20μL。方法线性范围为30.15~2010μg/mL,检出限为1.3μg/mL;用其测得酵母细胞中麦角固醇含量为2.74 mg/g,RSD为2.1%(n=5),加标回收率为91.6%~96.9%。     

3-磷酸甘油醛脱氢酶与酵母线粒体基因组维持蛋白Mgm101的相互作用

采用酵母双杂交方法, 以Mgm101p为诱饵, 筛选酵母cDNA文库. 分离鉴定15个与Mgm101p相互作用的蛋白因子, 其中5个阳性克隆均为GPD1编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH). 克隆了GPD1在 S. cerevisiae的同系物ScTDH2基因, 进行绿色荧光蛋白GFP标记、 亚细胞组分分离和蛋白质印迹分析, 结果表明, GAPDH除了在细胞质为糖酵解酶的主要作用外, 可能为多功能蛋白, 在酵母线粒体中与Mgm101p相互作用参与线粒体DNA维持的生物过程.     

基于RNA杂交的马铃薯纺锤块茎类病毒检测芯片

报道了一种检测植物类病毒RNA的新方法——RNA杂交芯片技术, 即将cDNA芯片技术与RNA斑点杂交技术相结合, 将马铃薯样品的总RNA直接固定在玻片上, 用荧光标记制备检测马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的特异探针, 探针与芯片杂交后分析杂交信号以确定相应的样品有无PSTVd侵染. 参照膜杂交的方法, 确定了RNA芯片的制备条件, 并用以检测了马铃薯样品的PSTVd侵染情况, 检测结果与RT-PCR结果相符, 阳性产物经克隆测序证实为PSTVd.     

酵母PHO4基因的结构改造与功能分析

酵母PHO4基因编码的蛋白质是阻遏型酸性磷酸酯酶基因表达系统中的正调控因子。本文根据由核苷酸序列推导的氨基酸序列对PHO4蛋白的结构域作了分析。通过寡聚核苷酸的插入或片段的缺失对PHO4基因的编码区进行改造,观察它们在细胞内对酸性磷酸酯酶基因表达的影响,推测不同结构区的功能作用。结果表明PHO4蛋白的第162到171位附近的氨基酸残基可能组成一个与负调控因子PHO80相互作用的功能区。     

咔咯锰(Ⅲ)配合物催化RNA磷酸二酯类似物HpPNP的水解断裂反应机理

采用密度泛函B3LYP方法研究了咔咯锰(Ⅲ)配合物催化水解断裂RNA磷酸二酯类似物2-羟丙基-4-硝基苯基磷酸酯(HpPNP)的反应机理以及中位取代基的性质和数目对反应能垒的影响。计算结果表明:断裂反应以特殊碱催化(SBC)机理进行,咔咯锰(Ⅲ)配合物与HpPNP形成双氢键和双配位独特的过渡态结构,经由P-O键断裂后形成产物。与无催化剂时相比,带吸电子取代基的咔咯锰(Ⅲ)配合物的催化能使反应能垒下降4%~34%。咔咯锰(Ⅲ)配合物中位的吸电子取代基效应能显著降低反应能垒,促进水解断裂反应的进行。