应用毒理蛋白质组学技术研究多环芳烃类物质诱导气道上皮细胞毒理作用的机制

为了更好地理解苯并芘(Benzo(a)pyrene, B(a)P)在气道细胞诱导的毒理作用机制. 应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)分离B(a)P处理组(B(a)P-A549)、对照组(DMSO-A549)的总蛋白质, 图像分析识别差异表达的蛋白质点, 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点, Western blot验证差异蛋白热激蛋白27 (heat shock protein 27, HSP 27)以及锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase, Mn SOD)的表达, 使用0.1, 1, 10 μmol/L B(a)P处理A549细胞, 应用Western blot及RT-PCR检测各组细胞中Mn SOD的表达, 检测各组细胞中总抗氧化活性(total antioxidant capacity)、总SOD活性(total activity of SOD)、过氧化氢酶活性(catalase activity, CAT)、谷胱甘肽还原酶活性(glutathione reductase, Gr). 本研究首先建立了B(a)P处理组、对照组的2-DE 图谱, 质谱鉴定了23个差异蛋白质, Western blot 证实HSP 27及Mn SOD的表达水平在B(a)P处理组中较对照组明显下调|使用0.1, 1, 10 μmol/L B(a)P处理A549细胞后, 发现随着B(a)P的浓度升高, 虽然Mn SOD的表达及SOD活性出现先诱导后抑制的现象, 但CAT及Gr活性的增高依然提高了机体的总抗氧化活性. 研究结果提示: HSP 27及Mn SOD 与B(a)P在气道细胞诱导的毒理作用相关, CAT及Gr在对抗B(a)P带来的氧化损伤方面可能具有十分重要的作用.     

麦胚凝集素亲和色谱富集糖肽过程中的肽键裂解

蛋白质的糖基化是最重要的翻译后修饰之一,与蛋白质结构和功能的关系密切。凝集素亲和色谱是蛋白质糖基化研究中很常用的工具,不同的凝集素可以对不同的单糖或寡糖有特异的富集作用。麦胚凝集素（WGA）由于其特异作用的糖型广泛存在而成为使用最多的凝集素之一。在本研究中,发现将WGA用于糖肽亲和富集会导致部分肽段的降解,从而导致后续的肽段序列分析的失败。本文用4种标准蛋白质对这种现象进行了验证,结果表明肽段的降解可以发生在多个位点,其中较多地发生在酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端。这一结果提示：在糖蛋白质组研究中,如果应用WGA富集糖肽并采用质谱进行鉴定,则采用半酶切或非特异性酶切的检索策略更为合适。     

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件.在pH 8.0的Na2B4O7/H3BO3 缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全.对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点.结果表明: 在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99, r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%.     

细胞蛋白质组学和代谢组学整合策略表征散斑型BTB/POZ蛋白质突变调控的关键代谢通路

散斑型BTB/POZ蛋白（SPOP）是前列腺癌中突变率最高的蛋白质之一。该研究通过整合细胞蛋白质组学和代谢组学的方法，揭示SPOP突变引起的代谢紊乱及其调控的代谢通路。首先，系统地研究了LNCaP SPOP野生型及突变型高表达细胞中的代谢变化。代谢组学结果显示，SPOP野生型和突变型（SPOP_Y87N和SPOP_F133L）导入的LNCaP细胞在偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）得分图上得到了很好的区分。进一步通过单因素方差分析发现，SPOP突变引起富马酸、苹果酸、柠檬酸、天冬氨酸和天冬酰胺等代谢物含量的增加。蛋白质组学共发现909种蛋白质在两种LNCaP SPOP突变体细胞中发生变化。分别对差异代谢物和差异蛋白质进行通路富集分析，发现三羧酸循环、氨酰基-转运核糖核酸生物合成在代谢组学和蛋白质组学分析中都发生了明显改变。最后，在SPOP敲除的Du145细胞中验证了上述研究结果。该研究证明SPOP突变可促进三羧酸循环。     

温敏核不育系水稻株1S及其矮秆突变SV14茎的蛋白质组学比较

采用双向凝胶电泳对温敏核不育水稻株1S和其矮秆突变体SV14的茎(穗颈下第1节和第2节)蛋白进行了分离,通过银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.选取了26个蛋白质点采用MALDI-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,最终有12个蛋白质点得到了可靠鉴定.其中在SV14中相对于株1S上调的仅有OSJNBa0039C07.13 蛋白,其它蛋白均表现为下调.这些差异蛋白按照功能可分为4类: (1) 能量代谢相关蛋白;(2) 次生代谢相关蛋白;(3) 调控蛋白;(4) 未知蛋白.对光合系统Ⅱ氧延伸复合物蛋白质前体2,果糖二磷酸醛缩酶,UDP-葡糖醛酸脱羧酶对应的基因进行了半定量RT-PCR分析,发现这几个基因与蛋白质的表达不一致,可能是RNA发生了翻译后修饰而减少了蛋白表达量的结果.这些差异蛋白很可能与水稻矮化有关,为水稻矮秆基因的寻找提供了另一个有效途径.     

N-糖基化蛋白质组样品富集策略的研究进展

蛋白质的糖基化是生物体内重要的蛋白质翻译后修饰之一,但其丰度通常较低,糖基化蛋白质酶解肽段中仅有2%~5%为糖基化肽段,因此,为实现糖基化蛋白质组的深度覆盖分析,对糖基化蛋白质/肽段进行富集是非常必要的。该文对糖基化蛋白质组样品不同富集方法的原理、特点以及最新研究进展进行了综述,同时也对N-糖基化蛋白质组学富集策略的发展前景进行了展望。     

微柱高效液相色谱-质谱/质谱快速鉴定混合蛋白质新方法

发展了一种混合蛋白质快速鉴定的新方法.将几种蛋白质的混合物于热变性后直接在溶液中酶解,利用微柱高效液相色谱-离子阱串级质谱进行肽谱/氨基酸序列分析,并结合Mascot数据库搜索处理功能,实现了混合蛋白质快速准确的鉴定.     

差异蛋白质组学研究技术新进展

随着多项基因组计划的完成,人们越来越倾向于借助蛋白质组学手段在整体水平研究复杂蛋白质样品。差异蛋白质组学比较不同生物体在不同时刻,状态下蛋白质表达的变化,已广泛应用于各种研究。相关技术的建立成为蛋白质组学的一个核心技术问题。不同方法对蛋白质差异分析的能力和原理不同,可分为提供相对含量信息的定量差异分析技术和提供有,无信息的定性差异分析技术。此外。还有专门技术用于蛋白质修饰的差异分析。多种技术手段的结合应用以及自动化、高通量分析已成为趋势,修饰研究成为新的研究热点,这些均将促进相关技术的进一步发展。本文介绍了差异蛋白组学研究技术及其进展。     

新型游离胶分馏器OFFGEL对SH-SY5Y细胞蛋白酶切后肽段分离性能考察

在基于鸟枪法鉴定蛋白的策略中,需要在肽段水平上进行高效良好的预分离。以人多巴胺能神经细胞瘤(SH-SY5Y)为研究对象,考察了游离胶分馏器(OFFGEL)分离肽段的性能。SH-SY5Y细胞全酶切肽段经过OFFGEL分离后,得到24个不同馏分,每一个馏分经过微流液相色谱-质谱检测,发现有83.7%的肽段是专属于一个馏分中,各个馏分中肽段平均等电点与理论值基本一致,且在pH低端肽段的等电点偏差较小,达到良好的聚焦效果。OFFGEL不但能同时分离多达16个样品,而且能够从溶液中回收样品,具有高通量、操作简单、方便后续质谱检测等优点。因此,OFFGEL在蛋白质组学中多肽的分离具有很好的应用前景。     

Easy-to-use Method to Display Arabidopsis Rubisco Interacting Proteins

Affinity-mediated protein separation is an integral part of proteomics, the most outstanding of which is immunoproteomics. However, in the immunoprecipitate system overwhelming Ab and Ag conceal Ag interacting proteins as the research targets, which is the rate-limiting step in the progress of comparative proteomic analyses. We presented a convenient and accurate method to tackle this problem. 1 mol/L NaCl elution buffer was applied to the complex Rubisco immunoprecipitate of Arabidopsis, the weakest force involved in the system was selectively broken up, resulting in the enrichment of Rubisco interacting proteins accessible for further comparative protein gel profile. The easy-to-use method sheds light on a narrow-down strategy supplement for comparative immunoproteomics.