多孔整体材料最新研究亮点

<正>1用作酶反应器载体酶反应器是蛋白质组学研究中一个重要的组成部分。具有诸多优点的整体材料作为构建微量蛋白酶反应器的理想载体受到了越来越多的关注。最近,中科院生态研究中心的汪海林研究小组[1]制备了一种新的毛细管整体生物反应器。他们首先以四甲氧基硅烷为原料制备了内径为     

色谱研究动态

经过近110年的发展,色谱已经成为应用最为广泛的仪器分析技术。色谱研究人员和技术人员也是当今最容易就业的一类分析化学专业人才。虽然色谱理论的发展还不是十分令人满意,但色谱技术已经相当成熟,即使上世纪80年代兴起的毛细管电泳(CE)研究热潮也已趋于平稳发展。那么,色谱研究人员还能干些什么呢?笔者通过观察和文献调研,在这里提出一些看法,供读者思考和批评。 色谱研究相对成熟的标志之一是在高水平杂志上发表的相关研究论文数目逐渐减少,比如在J. Am. Chem. Soc.(以下简称JACS)上,2009年以来发表的色谱相关论文有20余篇,但均不是直接研究色谱的,而是利用色谱作为表征技术来研究蛋白质、多肽、纳米材料、聚合物材料的。在Angew. Chem. Int. Ed.(以下简称Angew)上发表的论文也大体是这样。这说明有关色谱的基础研究目前很难产生影响整个化学学科发展的成果,虽然在Anal. Chem.这样的二级学科刊物上仍然有很多色谱研究论文发表。相比而言,在很多专业性和应用性的期刊上则有大量的色谱应用论文发表,证明色谱正在解决更多的应用问题。 那么,色谱研究人员现在在干什么呢?笔者认为可以大致分为三种情况:一部分原来的色谱研究人员转而研究微-纳流控技术或芯片实验室(还应该属于色谱范畴),这是一个非常有前途的研究领域。特别是原来从事CE研究的人员,很容易转而研究微通道(芯片)电泳。另一部分则是针对当前的热点科学问题,研究色谱技术的特殊应用。比如在蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、糖组学、脂质组学、材料科学、生命科学和环境科学等研究领域,色谱(包括CE)是必不可少的分离分析方法。不少色谱研究人员做了一些出色的工作,为相关领域的发展提供了重要的分析新技术和新方法。最近发表的工作有利用色谱作为表征技术来研究纳米材料(JACS, DOI: 10.1021/ja909133f; JACS, 2009, 131: 17093-17095, DOI: 10.1021/ja902293w)及其与其他物质的相互作用(JACS, 2009, 131: 17194-17205, DOI: 10.1021/ja9083623)、聚合物材料(JACS, 2009, 131: 13631-13633, DOI: 10.1021/ja905924u)、反应机理(JACS, 2009, 131: 16573-16579, DOI: 10.1021/ja904197q; JACS, 2009, 131: 11492-11497, DOI: 10.1021/ja9028928)、蛋白质和多肽的纯化(JACS, 2009, 131: 11306-11307, DOI: 10.1021/ja9048338; Angew, 2010, 49: 895-898, DOI: 10.1002/anie.200904413),以及复杂原油样品的分析(Angew, 2010, 49: 895-898, DOI: 10.1002/anie.200904413),等等。第三部分色谱研究人员仍然在探索创新的分离介质和方法。比如整体柱的制备与修饰、新型色谱器件和检测方法的研究。 下面介绍几篇最近发表的关于整体柱的制备与修饰、新型色谱器件和检测方法研究的论文供读者参考。 (1)整体柱功能化的新方法。整体柱的功能化目前主要采用功能化单体共聚合和/或聚合后功能化两种策略。比如硼酸盐亲和色谱(BAC)多用于含顺式二醇基团的糖或糖蛋白等生物分子的分离富集,但采用上述两种策略所得到的含硼聚合物整体柱都必须在碱性条件下工作,这可能导致生物样品的降解。为此,南京大学刘震教授研究组提出了一种新的整体柱功能化方法(Angew, 2009, 48: 6704-6707, DOI: 10.1992/anie200902469)。他们首先采用邻氨基苯基硼酸与1,6-六亚甲基二胺反应生成稳定的含B-N键的配合物,然后与环氧树脂实现开环共聚合,形成表面含有相邻氨基和苯基硼酸基团的聚合物整体柱。在中性(或碱性)条件下,相邻两基团不发生配合作用,而硼酸基团可以与待分析样品中含顺式二醇基团的物质发生配合作用。因此这类整体柱可在中性pH条件下富集(保留)含顺式二醇基团的糖或糖蛋白质,流动相变为酸性时便可将保留的物质洗脱下来。在糖蛋白组学和糖组学研究中,这类聚合物整体柱可能发挥非常重要的作用。 (2)新型高效液相色谱(HPLC)泵。迄今为止,HPLC高压泵基本都是活塞式往复泵,虽然有人研究过超声波、磁流体力学、电渗流、电动力学和电化学泵,但都不足以产生毛细管HPLC所需的压力。Pawliszyn (Anal. Chem., 1995, 67: 212-219)、Miller (Anal. Chem.,1988, 60: 1965-1968)和Hjerten (Anal. Chem., 1998, 70: 366-372)等教授的研究组曾报道过液体热膨胀泵,显示了诱人的应用前景。最近,复旦大学张祥民教授研究组在热膨胀泵研究方面取得了很好的结果(Anal. Chem., 2010, 82: 842-947, DOI: 10.1021/ac901855t)。他们首先从理论上推导了热膨胀泵的液体膨胀系数、温度、压力等因素与流速之间的关系,然后加工构建了以不锈钢膨胀室(内充水)、陶瓷管外缠绕电加热丝和热电偶构成的热膨胀泵;采用4个单元热膨胀泵和2个阀构成了梯度系统,流速范围为0.05～5.00 L/min。最后通过性能评价和氨基酸样品的梯度分析证明:该系统可用于毛细管HPLC的等度和二元梯度洗脱分析,显著降低了仪器和运行成本。 (3)气相色谱(GC)通用定量检测系统。寻找一种不用标准样品和校正过程就能实现准确定量分析的色谱检测器一直是色谱研究人员的追求,在这方面,柱后同位素稀释和电感耦合等离子体质谱(ICPMS)作为GC和HPLC的检测器已有成功的应用。但是碳在等离子体中的离子化效率很低,加上高的碳背景信号,导致了分析灵敏度不高,大大制约了该技术的应用。更重要的是ICPMS检测得不到化合物的结构信息。最近,西班牙University of Oviedo的Alonso教授研究组报道了一种GC通用的柱后碳同位素稀释定量检测系统(Angew, 2009, 48: 2561-2564, DOI: 10.1002/anie200805545),该系统不需要标准样品,也不需要校正过程,就能实现GC分离的有机化合物的准确定量分析。其原理是在GC柱后加一个燃烧反应器,将有机化合物转化为CO2,并连续加入13CO2,再用电子轰击离子化质谱（EI-MS）进行检测。这样就可实现与化合物结构无关的离子化(无论用什么离子源),进而通过同位素比实现准确定量。当不用燃烧室时,就可以获得化合物的MS结构信息。 (4)微流控反相HPLC芯片与四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF MS)联用分析磷酸化多肽。LC-MS/MS是目前蛋白质组学分析的主要技术,如何实现高丰度蛋白质的在线去除和低丰度蛋白质的在线富集是一个研究热点。荷兰Utrecht University的Heck教授研究组最近报道了他们在磷酸化多肽富集、分离和鉴定方面的研究进展(Anal. Chem., 2010, 82: 824-832, DOI: 10.1021/ac901764g)。他们采用反相-TiO2-反相HPLC芯片与Q-TOF MS联用,成功实现了大量磷酸化多肽的在线富集和鉴定。该方法用于人类白血球磷酸化蛋白组学的研究,共鉴定了1012个磷酸化多肽,相应于960个不同的磷酸化位点。 (5)集成微流控装置自动分析单细胞。单细胞分析是分析化学的前沿领域。美国University of North Carolina at Chapel Hill的Ramsey教授研究组最近报道了一种整体集成微流控装置(Anal. Chem., 2010, 82: 967-973, DOI: 10.1021/ac902218y)。该装置集成了包括溶胞部分、电泳分离通道和电渗泵驱动的电喷雾喷头,它直接连接到MS上,实现了单细胞的在线分析。作者以红细胞为模型体系,检测到了单个红细胞中的血红素和α、β亚单位血红蛋白,分析通量达到了每秒12个细胞。该装置有望用于单细胞的高通量分析。     

基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展

质谱技术已经成为目前蛋白质鉴定的重要工具。定量分析细胞内蛋白质组的动态变化,是当前研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标的迫切需要。本文综述了基于质谱技术蛋白质定量的策略、方法和应用等方面近年来的进展,评述了几种蛋白质质谱定量方法的特点和应用潜力。     

蛋白质组学技术筛选与鉴定癫痫疾病的差异蛋白质

应用蛋白质组学双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)和质谱技术, 定量分析和鉴定了癫痫组(n=3)和正常组(n=3)脑组织的差异表达蛋白, 以从蛋白质水平上揭示癫痫病的发机制. 结果表明, 凝胶图谱可辨识2500~3000个蛋白点, 对21个显著差异表达蛋白点进行质谱鉴定和SwissProt数据库检索, 得到17个癫痫差异蛋白, 其中2个蛋白在癫痫组织中表达上调, 15个蛋白表达下调. 部分蛋白与癫痫的关系属首次报道. 这些蛋白与癫痫的发生发展相关, 可能成为癫痫的分子标志物和药物治疗的靶向蛋白.     

无标记定量法研究冠心病不稳定性心绞痛血瘀证的差异蛋白质组

应用高解析离子淌度质谱(HDMS)与纳升级超高效液相色谱(UPLC)联用, 寻找冠心病不稳定性心绞痛血瘀证血浆差异蛋白, 探索冠心病不稳定性心绞痛血瘀证的蛋白质组学特点. 采用美国Agilent公司多克隆抗体亲和柱去除冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者和健康人血浆中6种丰度最高的蛋白后, 进行无标记定量蛋白质组(Label free proteome)分析. 结果表明, 本方法的离子强度变异系数小于5％, 保留时间变异系数小于3％, 具有良好的重现性. 动态范围约104数量级. 总蛋白数3843种, 差异倍数大于1.5倍的差异蛋白数25种, 上调蛋白数13种(包括心绞痛血瘀证患者独有蛋白3种), 下调蛋白数12种. ACTA1, ITIH3和 LBP仅在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者血浆中表达, Haptoglobin, SAA, CP, C6, MYH11, APOH和ANXA6在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中高表达, 而HBB, HBA, HBE, HBD, HBG, HRG, IGHG, GSN和TF在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中低表达. 表达上调的差异蛋白根据功能可分为: (1) 急性时相反应蛋白; (2) 补体蛋白; (3) 细胞骨架蛋白; (4) 凝血相关蛋白. 表达下调的差异蛋白根据功能可分为: (1) 载脂蛋白; (2) 运输蛋白; (3) 抗凝血相关蛋白; (4) 免疫球蛋白; (5) 细胞骨架调控蛋白. 以上结果提示, 冠心病不稳定性心绞痛血瘀证可能属于一种炎症反应; 冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者可能同时存在心肌损伤、凝血因子异常、脂代谢紊乱与氧运输障碍; 这些方面相互影响, 互为因果. 这些差异蛋白可为研究或发现抗心绞痛药物作用的新靶标提供线索. 本研究结果表明, 非标记定量蛋白质组学(Label free proteomics)是疾病及证候生物标志物研究的一种有效手段.     

新型鳞片状聚合物修饰硅胶填料固定化酶的制备及其在蛋白质组鉴定中的应用

利用原子转移自由基聚合法制备了鳞片状聚合物修饰的硅胶填料,将其作为一种新型的固定化酶载体,实现了蛋白酶的高密度固定,从而明显缩短了复杂蛋白质样品的酶解时间。使用标准蛋白质对固定化酶的酶解效率进行了考察,结果表明: 鳞片状聚合物修饰的新型固定化酶硅胶填料具有较高的酶解效率,酶解标准蛋白质1 min后,鉴定到肽段的氨基酸序列覆盖率可达95%以上。将该固定化酶硅胶填料成功应用于大肠杆菌全蛋白质的酶解,从2 min酶解肽段的混合物中鉴定到的蛋白质数量超过同样条件下溶液酶解12 h的结果。另外,该固定化酶硅胶填料可以重复使用,其酶解效率具有良好的稳定性和重现性;该固定化酶具有较好的样品回收率,因而可以应用于蛋白质组学研究中。     

蛋白质组驱动的精准医学研究进展

蛋白质是细胞的重要组成成分,参与人体各种代谢及生理功能的调控.蛋白质组学可以分析蛋白质表达水平、修饰状态和细胞内蛋白质相互作用,为研究这些分子在疾病发生和发展的不同阶段的变化提供了全局视角.近年来,临床蛋白质组学已被证实在疾病的早期诊断、预后和病情发展监测中发挥重要作用,并由此提出了蛋白质组学驱动的精准医学的概念.该文...     

比较纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱用于自顶向下蛋白质组学

自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。     

新型亲和去垢小柱净化-液相色谱-串联质谱法分析水稻叶片蛋白质组

采用亲和去垢小柱净化,建立了水稻叶片蛋白质组的纳升液相色谱-串联质谱分析方法。水稻叶片蛋白质分别采用酚提取法结合十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解,裂解液经亲和去垢小柱净化,酶解肽段用纳升液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(nanoLC-LTQ/Orbitrap MS)分析,相关数据库检索鉴定。比较了超滤辅助样品制备法(FASP法)、亲和去垢小柱法和丙酮沉淀法对SDS去除效率及对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明:3种方法均有较好的SDS去除效果(去除效率均大于95%);尽管3种方法鉴定的蛋白质种类具有一定的互补性,但以亲和去垢小柱法鉴定的蛋白质数目最多,为563种,远多于FASP法和丙酮沉淀法的196和306种;此外,亲和去垢小柱法适合于各种相对分子质量和不同pI值蛋白质的净化,而FASP法和丙酮沉淀法中不同相对分子质量和pI值蛋白质均有类似程度的损失。采用本文建立的方法,一次进样分析可鉴定出水稻叶片蛋白质多达588种;肽段匹配数≥2的296个蛋白质的生物学功能主要分为结合活性、酶活性、转移运输活性和结构组成等。该蛋白质分析方法可为开展水稻蛋白质组学研究提供技术参考。     

Proteomics Dissection of Cold Responsive Proteins Based on PEG Fractionation in Arabidopsis

Proteome profiling was performed on Arabidopsis plant exposed to cold stress at 4 ℃ for 24 h in an attempt to explore the mechanisms of plant climate adaptation.The polyethylene glycol（PEG） fractionation protocol developed in this lab was used to identify as many differentially expressed low-abundance proteins as possible.In comparison with those of the biological controls,67 protein spots with at least two-fold difference in expression were identified for the plant exposed to cold temperatures; and from these spots,50 proteins were successfully identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）.Bioinformatics studies on these proteins show that 57.8％ of these proteins were localized in the chloroplast.Of these proteins,8 ones have functions in photosynthesis,including glycine hydroxymethyltransferase,Rubisco large subunit,Rubisco activase,PSBO2,fructose-1,6-bisphosphate aldolase,NADP-dependent malate dehydrogenase,sedoheptulose bisphosphatase and photosystem Ⅱ reaction center PsbP family protein,suggesting that photosynthesis is greatly affected by cold stress.The identified proteins were validated by quantitative real-time polymerase chain reaction（qPCR）.Taken together,our results suggest that the chloroplast might also act as a cold stress sensor and that photosynthesis-related proteins may play important roles in cold acclimation for Arabidopsis.