基于分子信标探针和生物功能化纳米颗粒的蛋白质分析

随着人类基因组测序计划的完成,生命科学研究热点逐渐由基因组学向蛋白质组学转移.分析化学工作者利用分子信标探针和生物功能化纳米颗粒的固有优势,发展了一系列新原理、新方法和新技术并在蛋白质组学研究领域得到了广泛应用,极大地促进了蛋白质组学的发展和进步.本文主要综述了基于分子探针和生物功能化纳米颗粒开展的一系列实时、原位、灵敏、特异的蛋白质分析研究,包括:非特异性/特异性蛋白质的检测与分离、蛋白质/DNA相互作用研究、细胞表面蛋白质的识别,以及基于抗原-抗体反应的病原菌检测等,并进一步展望了基于分子信标探针和生物功能化纳米颗粒的蛋白质分析研究的发展前景与关键问题.     

蛋白质组学研究中傅立叶变换离子回旋共振质谱数据采集方法的比较

探讨了线性离子阱-傅立叶变换离子回旋共振质谱(LTQ-FT)的数据采集模式对蛋白质组鉴定结果的影响,比较和分析了针对不同复杂程度样本的最佳采集模式.对于α-乳清蛋白4种标准蛋白质酶切肽段混合物的简单体系,在傅立叶变换离子回旋共振腔中选3个最强母离子进行选择离子监测扫描后, 再实施二级碎裂的方法(SIM3) 得到的肽段覆盖率, 分别是直接选10个最强母离子进行二级碎裂(FT10)方法得到的肽段覆盖率的1.5～1.9倍.另外, 对酵母蛋白酶切肽段混合物的复杂体系鉴定时,只采集双电荷和三电荷母离子进行二级扫描的方法(FT10_23)比单电荷、双电荷和三电荷都采集的方法(FT10_123)得到的图谱鉴定成功率提高64.1%.实验还对不同数据采集模式下图谱的特点进行了考察.本研究表明,针对不同复杂程度的样本,应采取不同的质谱数据采集方法.     

柠檬酸钆配合物对宫颈癌细胞作用的蛋白质组学研究

为研究稀土化合物抗癌作用及其机制,本文采用差异蛋白质组学方法研究钆对宫颈癌细胞(HeLa)的作用,以四噻唑蓝比色法(MTT法)检测柠檬酸钆配合物([Gd(Cit)2]3-)对HeLa细胞生长的影响,并用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态,利用双向凝胶电泳技术分离[Gd(Cit)2]3-作用HeLa细胞前后的蛋白,经图像分析后对蔗异点,进行MALDI-TOF-MS鉴定和数据检索.结果表明0.005～1 mmol·L-1浓度范围内的[Gd(Cit)2]3-对HeLa细胞生长的影响存在浓度依赖性.Hoechst 33258染色结果表明0.07 mmol·L-1[Gd(Cit)2]3-作用24 h对HeLa细胞的生长的抑制率为34%.质谱共鉴定出12个差异表达蛋白质点,包括延伸因子2、过氧化酶6、亲环蛋白A、烯醇酶1等在细胞中分别参与蛋白质转录与翻译、氧化应激、信号传导等过程的蛋白质.提示[Gd(Cit)2]3-可能通过调节胞内氧化应激水平,介导与调控信号转导与蛋白质表达等,从而诱导HeLa癌细胞凋亡.     

色谱最新进展

1可媲美二维液相色谱-质谱联用技术的一维毛细管液相色谱-串联质谱技术 如今二维鸟枪式(shotgun)液相色谱结合串联质谱用于蛋白质组学的研究屡见报道,通常使用反相液相色谱和其他可以正交的分离模式联用结合串联质谱可以分离上千种蛋白质。由于整体硅胶柱具有优越的渗透性,因此其可以长柱形式实现高效分离;结合平缓的梯度洗脱可以分离高复杂性的样品。日本Keio University的Yasushi Ishihama等成功地将整体硅胶柱应用于一维液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)中,鉴定了大肠杆菌细胞表达的蛋白质组。他们使用的是一根长350 cm、内径100 μm的整体硅胶-C18毛细管柱来进行鸟枪式蛋白质组分析。实验中将4 μg大肠杆菌的胰蛋白酶酶解物进样至整体柱,随后启动一个长达41 h的梯度程序,采用流量为500 nL/min、压力不超过20 MPa的非超高压液相色谱条件,最终大肠杆菌中2602种蛋白质(包括830种膜蛋白)的22196条非冗余肽段得到了鉴定。相比使用传统的15 cm长、3 μm粒径的C18硅胶填充柱的LC-MS/MS,该体系可以获得较之平均高约5倍的峰响应值。如此高的响应值可能是因为使用长的整体硅胶柱以及缓慢的梯度获得的高效分离大大降低了电离抑制影响的缘故。因为这个高分辨率的体系不需要任何预分离,这种单次蛋白质组学检测方法可以大大地简化鸟枪技术的工作量,也降低了所需样品量,虽然采用了长时间的缓慢梯度,但是仍然减少了总的分析时间。(来源: Anal. Chem., 2010, 82: 2616-2620) 2纳米结构启动质谱技术 质谱在检测生物分子方面有很大的潜力,但现有方法仍存在灵敏度不够高、需要基质分子促使分析对象发生离子化等缺陷。纳米结构启动质谱(nanostructure-initiator mass spectrometry, NIMS)技术使用纳米结构表面的“启动子”或者“笼状物”进行释放和离子化吸附在其表面的完整分子,能以极高的灵敏度分析非常小的区域,从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析,而且还能用于组织成像。此技术克服了一般质谱方法灵敏度低和需要基质辅助离子化的缺陷。近几年,来源于动植物油脂及微生物代谢的生物柴油因其具有广泛的适用性而受到关注。由于柴油的品质与其脂肪酸的含量和性质密切相关,因此建立与当今代谢工程匹配的最佳脂肪酸克隆体高通量分析方法是生物柴油发展的关键。Wolfgang Reindl和Trent R. Northen将NIMS技术作为一种快速简便的分析手段用于植物及微生物脂肪酸的分析。研究证明,NIMS技术在负离子模式下可实现大量饱和及不饱和脂肪酸的直接检测,并且在几个数量级范围表现出良好的线性关系,检出限可达fmol级;另外,可以实现微量橄榄油、黄豆油和藻类短杆菌肽的定性及定量分析。NIMS的独特表面允许样品进行原位净化,这使得信噪比可以达到10倍以上。这项研究为植物及微生物油脂的快速分析奠定了基础,促进了生物柴油的发展。(来源: Anal. Chem., Article ASAP DOI: 10.1021/ac100159y, Publication Date (Web): March 31, 2010, in press) 3在线毛细管电泳-激光诱导荧光检测-多级质谱(CE-LIF-MSn)技术用于母乳喂养婴儿的食用母乳和粪便中寡聚糖图谱的建立 CE-LIF常被用在碳水化合物的检测分析中。没有紫外吸收的碳水化合物经过衍生可以在很低浓度水平被检出,灵敏度可达到pmol,所以在复杂生物样品的检测中CE-LIF备受关注。但是对检出物质进行确认却是一个复杂和耗时的过程。CE-MS则在物质鉴定方面有独特的优势。荷兰Wageningen University的Henk A. Schols教授课题组将在线CE-LIF-ESI(电喷雾离子源)-MSn用于母乳喂养婴儿的 食用母乳和粪便中的寡聚糖图谱的建立。LIF通过CE毛细管上的窗口进行柱上检测,毛细管中的液体通过一个鞘流接口进入到MS中。这种设计可以在同一次分析中既得到LIF信号又得到离子强度信号,并可将两组信号进行相关分析以进行物质确证。通过在线CE-LIF和ESI-MS串联对母乳喂养婴儿所食的母乳和其粪便中8-氨基芘-1,3,6-三磺酸钠盐(APTS)衍生的人乳低聚糖物质(HMOs)分析图谱的比较,对HMOs在胃肠道中的代谢有了进一步的认识。与母乳中的寡聚糖相比,在母乳喂养婴儿的粪便中确证了lacto-N-fucopentaose (LNFP)和lacto-N-neo-tetraose(LnNT)两种新的异构体。通过粪便中的寡聚糖图谱可以推断出高相对分子质量的HMOs在胃肠道中的生物转化和降解。(来源: Electrophoresis, 2010, 31: 1264-1273) 4动态针捕集技术在临床呼气试验中的应用 现代分析科学为各领域的实际应用提供了有效的途径和手段,在医药学领域,使用超痕量分析对人呼气中存在的挥发性生物标志物或药物进行检测的新型诊断方式便是一例。德国罗斯托克大学的Maren Mieth等曾提出个性化的动态针捕集技术用于呼吸气体的取样和富集(见: Anal. Chem., 2009, 81: 5851-5857)。动态针捕集技术利用装有吸附填料的捕集针对所要分析的气体进行采集,在样品处理方面较之固相萃取或者固相微萃取技术更加快速、灵敏、稳定、即时。最近,他们又首次在医疗机构的临床条件下,针对低量(20 mL)呼出气体,完成了多床层动态针捕集联合中心切割气相色谱/质谱法(GC/MS)和全二维气相色谱/飞行时间质谱法(GC×GC/TOF-MS)的分析。为了实现快速有效的分离分析,他们应用高通量自动化解吸和分离系统,采用22根不锈钢针（60 mm×0.41 mm i.d., 0.72 mm o.d.）捕集气体,针管吸附物可稳定存在约7.8 h。实验中首先建立中心切割GC/MS方法,在消除了高浓度的挥发性消毒剂和麻醉剂的背景干扰后,采用该体系成功地测定了11位接受心脏手术病人的呼出气体,找出了5种病人呼出物随时间变化(术前、 术后各时间点)的规律,显示了此方法具有作为判断病情发展的辅助手段的良好潜力。接下来又采用GC×GC/TOF-MS对被分析物进行无偏向性的筛查和鉴定,从一位麻醉后病人呼出物的分析结果可以看出,采用该方法能检测到超过200种物质,并可成功地鉴定其中的60种。因此,可将检测结果作为进一步筛查标志物的依据和基础。此项研究表明了动态针捕集技术结合色谱-质谱联用能够为临床呼气试验提供特定的解决问题的途径。(来源: Anal. Chem., 2010, 82: 2541-2551) 5采用小分子作为亲和色谱配体纯化蛋白质的新方法 亲和色谱(AC)是目前进行蛋白质纯化的最有效的色谱分离技术,但现有配体基本上是蛋白质,使该技术的使用范围受限,同时又具有价格昂贵和易降解的缺点。采用化学稳定的小分子配体将大大扩大AC在生物药品净化上的使用范围,但设计能与大分子蛋白质紧密并特异性结合的小分子存在很大的技术难度。丹麦University of Copenhagen的J. E. Rasmussen和K. J. Jensen等报道了一个完 整的用于开发和建立新型小分子亲和树脂的综合方法。该方法组合了虚拟筛选和颗粒上自动串行库筛选,其中使用了一种新的光编码方案促进结构的全面完整的“一珠一化合物”库的亲和力映射。他们用该方法制备了用于识别人生长激素(hGH)的小分子亲和树脂,并评价其对大肠杆菌裂解液中hGH的选择吸收和洗脱能力,hGH的纯度(91%)和回收率(61%)均较好。(来源: Angew. Chem. Int. Ed., published online: 18 Mar, 2010)     

模拟微重力效应引起大鼠脑氧化应激与Na~+,K~+-ATP酶表达下调

采用地基模拟微重力效应的大鼠吊尾模型重现了微重力环境导致的氧化应激现象。对脑组织中OH自由基及丙二醛含量测定结果表明,吊尾组大鼠脑纹状体及海马均较其对照组显著性升高,反映了脑中发生了明显的氧化应激。通过比较蛋白质组学方法测定了纹状体突触蛋白的差异表达情况,发现鉴定到的所有ATP酶的表达均发生下调。这些结果表明,微重力效应的影响与氧化应激增强、Na+,K+-ATP酶表达或活性下降密切相关,为进一步探究微重力环境的作用机制及其对于生理系统造成的其它损伤研究提供了依据。     

创新数据非依赖性采集用于复杂基质目标蛋白质的定量分析

数据非依赖性采集( DIA)是随着定量蛋白质组学而建立的质谱扫描技术。 DIA能够获得扫描范围内所有母离子及二级子离子信息,不会造成低丰度离子信息的丢失,同时突破了高分辨质谱二级定量的通量限制。本研究基于静电场轨道阱Q-qIT-OT三合一质谱,发展了经典DIA方法以及WiSIM-DIA和Full MS-DIA两种全新DIA方法,并对Hela细胞全蛋白中添加的10条低浓度肽段进行定量分析,考察方法的线性、重现性和灵敏度。结果表明,3种方法的定量限均低至amol (14~435 amol),并展示出良好的线性和定性确证可靠性。其中,WiSIM-DIA基于超高分辨一级监测定量,与经典DIA优势互补;Full MS-DIA的选择窗口仅3 amu,能够直接进行搜库鉴定,实现了数据依赖性采集( DDA)和DIA的统一,摆脱了DIA依赖于DDA建立谱图库的局限性。     

蛋白质棕榈酰化修饰的分析方法进展

棕榈酰化修饰是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式之一,在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中都起着重要的作用。因此,定性和定量分析蛋白质棕榈酰化修饰对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年出现的蛋白质棕榈酰化修饰分析技术和方法及其优缺点,并对其未来的发展趋势进行了展望。     

AB SCIEX下一代蛋白组学平台为蛋白组学研究带来了全新的变革

2014年6月17日,全球生命科学分析技术的领导者AB SCIEX公司宣布推出用于定量蛋白质组学的革新性解决方案—配备SWATHTM采集技术2.0的TripleTOF6600系统。这款高分辨率、精确质量,并结合最新SWATHTM采集技术2.0的质谱系统,为先进的生物标志物发现与系统生物学领域中面临的蛋白组学数据的挑战带来了全新力量。当前蛋白组学研究重心正在从发现阶段转移到全面的定量分析,AB SCIXE公司的解决方案具有独特的优势,能够实现跨越大样     

N-糖基化蛋白质组样品富集策略的研究进展

蛋白质的糖基化是生物体内重要的蛋白质翻译后修饰之一,但其丰度通常较低,糖基化蛋白质酶解肽段中仅有2%~5%为糖基化肽段,因此,为实现糖基化蛋白质组的深度覆盖分析,对糖基化蛋白质/肽段进行富集是非常必要的。该文对糖基化蛋白质组样品不同富集方法的原理、特点以及最新研究进展进行了综述,同时也对N-糖基化蛋白质组学富集策略的发展前景进行了展望。     

赖氨酸C端内切酶/胰蛋白酶顺序酶切在蛋白质组学样本制备中的评估

采用胰蛋白酶(Trypsin)单独酶切与不同酶量的赖氨酸C端内切酶(Lys-C/trypsin)顺序酶切两种方法,对293T细胞全蛋白样本进行酶解消化,系统评估Lys-C/trypsin顺序酶切与Trypsin单一酶切在蛋白质组学样本制备中的差别.实验结果表明,Lys-C/trypsin顺序酶切不仅能显著提高肽段和蛋白质的鉴定数目,同时降低遗漏K酶切位点的数目及比例,而且得到的肽段长度有利于质谱鉴定,蛋白质覆盖率明显提升.通过对酶的用量进行优化对比,最终确定了Lys-C/trypsin顺序酶切时酶的合理用量.本研究结果对提高蛋白质组学样本的制备质量以及蛋白质的序列鉴定覆盖度具有指导意义.