铜离子与SALI3-2蛋白的相互作用

用1/2 MS固体培养基培养拟南芥幼苗, 研究了CuCl₂对转Sali3-2基因植株生长的影响, 发现转基因植株Sali3-2的表达可提高其耐受Cu²⁺胁迫的能力. 进一步克隆Sali3-2基因, 表达并纯化了缺失信号肽的 SALI3-2 蛋白. 利用固定金属离子亲和色谱(IMAC)分析发现, Cu²⁺ 能够与 SALI3-2 蛋白结合. 通过荧光光谱及圆二色光谱(CD)进一步研究了Cu²⁺ 与 SALI3-2 蛋白间的键合机理. 结果表明, Cu²⁺ 可引起SALI3-2 蛋白内源性荧光猝灭, 其猝灭机制为静态猝灭; Cu²⁺ 与SALI3-2 蛋白的结合常数为8.89×10⁶, 结合位点数为1.6. CD分析显示, Cu²⁺ 与SALI3-2 蛋白的结合未使SALI3-2 蛋白二级结构发生明显改变. 由此推测, 在高浓度铜离子胁迫下, SALI3-2蛋白通过结合一定数量的Cu²⁺使蛋白的构象发生改变, 这可能是SALI3-2蛋白的表达使植物耐受Cu²⁺胁迫能力提高的分子机制之一.     

稻壳纤维的柱层析性能研究

试验了稻壳纤维作为柱层析介质的性能,并制成亲和层析介质经脂肪酶。结果表明稻壳纤维层析过程为化学物理混合吸附过程,亲和层析性能良好,层析可将脂肪酶纯化２倍,回收率达８１．６％。适合较大规模层析分离。     

新型聚乙烯醇系亲和吸附剂的制备及其在糖蛋白纯化中的应用 (I)基质合成

以醋酸乙烯酯（ＶＡＣ）和甲基丙烯酸缩水甘油酯（ＧＭＡ）为单体,甲基丙烯酸烯丙酯（ＡＭＡ）为交联剂,在致孔剂正庚烷／乙酸丁酯的存在下,悬浮聚合,制得了一系列大孔共聚物;醇解后得到一种新型聚乙烯醇系亲和层析基质。依据单体的Ｑ、ｅ值,计算了体系的竞聚率,讨论了不同交联度、ＧＭＡ含量、致孔剂用量及配比对基质孔结构和性能的影响。     

壳聚糖-硅基凝胶微球作为固定化金属螯合亲和色谱基质的研究

采用溶胶凝胶及微乳液技术制备了以壳聚糖-硅基杂化材料为骨架并带有金属离子螯合官能团的球形基质(CSHB),并对该基质的制备条件及结构形貌进行了研究与表征。实验表明,当微乳液反应体系的组分为:100mL壳聚糖溶液(2%m/V)、100mL Span乳化剂、250mL环己烷、13.3mL四乙氧基硅烷(TEOS)、1.33mL 3-缩水甘油丙氧基三甲氧基硅烷(GPTMS)和亚氨基二乙酸(IDA)0.802g时,可获得粒径均匀,刚性较好的微球。红外光谱证明了该基质是一种多组分的杂合材料,差热分析数据表明该杂合材料的热稳定性随反应体系中GPTMS的含量增加而增大。CSHB通过动态吸附金属离子Cu2 与Ni2 后,可对金属螯合蛋白产生配位吸附作用。Cu2 -CSHB柱对牛血清蛋白(BSA)具良好的可逆吸附能力,蛋白能被咪唑等金属离子螯合剂洗脱,回收率达76.6%。BSA在CSHB柱上的吸附率只有4.7%,表明CSHB对蛋白的非特异吸附较低。Ni2 -CSHB柱对过氧化氢酶(CAT)也显示出初步的纯化效果,一步纯化倍数为2.43倍。该基质有望用于具有组氨酸纯化标签的基因工程表达蛋白的分离与纯化。     

壳聚糖涂层亲和层析介质合成的研究

研究了壳聚糖涂层亲和层析介质的制备工艺。采用合适的涂层条件，壳聚糖在玻璃珠上一次涂层量可达34mg／g介质。采用二氯化物交联剂可提高壳聚糖涂层介质的稳定性。当pH＞4．3时，交联壳聚糖涂层介质对Cu2＋的吸附容量达13．6mgCu2＋／g壳聚糖。在本介质的膨胀床中，最大液体流速可达1m／h。     

新型聚乙烯醇系亲和吸附剂的制备及其在糖蛋白纯化中的应用* II. 吸附剂制备

利用已合成的聚醋酸乙烯酯－甲基丙烯酸缩水甘油酯－甲基丙烯酸烯丙酯大孔共聚物,醇解后与6-氨基正己酸反应,进一步在EDAC的作用下实现与间氨基苯硼酸的偶联,得到亲水性的亲和吸附剂;配基密度为0.865mmol/g干树脂,偶联效率为89％。以云芝糖肽作为目标物质,吸附容量为53.7mg/g干树脂,为醇解前的7.7倍。     

具有生物活性的人带3蛋白胞质片段融合蛋白的克隆、表达与纯化

用PCR法从质粒pHB3中扩增了人红细胞带3蛋白胞质片段(CDB3)基因.PCR产物经限制性内切酶切割后与多克隆位点处带有编码6个组氨酸序列的高效表达载体pET28b连接,构建为重组子pCDBHistag.重组子经酶切及序列测定后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,可溶性目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右.C端带有6个连续组氨酸的带3蛋白胞质片段作为融合蛋白不仅可以降低宿主菌蛋白酶对其水解程度,而且简化了目的蛋白的纯化过程.经一步螯合Ni²⁺的亲和层析获得了电泳纯的带3蛋白胞质片段融合蛋白.活性测定结果表明,带3蛋白胞质片段融合蛋白能够抑制醛缩酶(Aldolase)活性的70%,与文献报道的人红细胞内带3蛋白胞质片段具有相同的功能.     

应用卵黄免疫球蛋白作为亲和配基分离目的蛋白的研究

实验通过给母鸡注射抗原BSA－V，从鸡蛋中分离获得抗体IgY。以BSA－V作介质分离纯化IgY后，IgY纯度可达电泳纯，且抗体活性提高了35倍以上。反之，将纯化后的特异性IgY为介质亲和分离胎牛血清中的BSA，分离后的BSA纯度可达电泳一条带，明显高于市售产品。以卵黄免疫球蛋白为配基的亲和介质在4℃条件下可保存半年以上，且柱的最大载量基本保持恒定。同时测定出卵黄中特异性IgY可占到总IgY的5％左右。     

亲和层析固定相的制备及应用研究

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,氨基三乙酸(NTA)为配基,制备固载金属离子的亲和吸附剂,试验了交联剂浓度、配基浓度、偶联温度及时间对配体固载量的影响,最佳条件为戊二醛浓度0.55%、NTA浓度0.4mol·L-1、偶联温度65℃、偶联时间10h。层析分离纯化豆类脲酶,锌柱和镍柱的酶回收率分别为88.5%和80.4%,纯化倍数分别为3.7和6.1,实验结果表明镍柱对脲酶有较高的分离纯化选择性。     

环氧基活化凝胶的开环反应

由自制的乙酸乙烯酯－甲基丙烯酸缩水甘油酯－甲基丙烯丙酯大孔共聚物与氨水反应，实现了环氧基的开环反应。考查了不同的氨水浓度、反应温度和时间对胺化转化率的影响，并测定了形成的伯胺基的ｐＫａ值为６．９。开环反应最适条件为：每克干树脂加入１．３ｍＬ的１３ｍｏｌ／Ｌ的氨水６０℃反应３ｈ以上，转化率达到６０％。