双光子荧光与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术的实验研究

双光子荧光与相干反斯托克斯拉曼散射同属于三阶非线性效应,二者之间的差异与联系是一个值得研究的问题.本文基于自行搭建的超连续谱近红外宽带相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统进行光谱成像,同时通过理论与实验对比分析了双光子荧光与相干反斯托克斯拉曼散射图像存在差异的原因.结果表明,具有亚微米以上横向分辨率的相干反斯托克斯拉曼散射成像系统,可以使用较大尺寸的荧光珠进行双光子荧光成像,通过解卷积得到双光子荧光成像的系统分辨率,并将它近似等效于相干反斯托克斯拉曼散射成像系统的当下分辨率.如果需要得到相干反斯托克斯拉曼散射成像系准确的分辨率结果,就必须使用尺寸比相干反斯托克斯拉曼散射成像系统实际分辨率小的球形样品进行实验测量.     

高精度实时主动轴向防漂移系统研究

基于单分子定位的荧光纳米分辨显微成像中, 系统漂移会使得单分子定位出现额外偏差, 从而使重构图像的分辨率降低, 造成图像模糊. 因此, 对系统漂移量的控制至关重要. 近年来, 防漂移的方法层出不穷. 本文针对其中一种利用光学测量原理和引入负反馈的防漂移方法做了系统的研究, 分析了其原理和实现过程, 对整个系统进行了误差分析, 通过实验标定了整个防漂移系统的精度. 该系统可以主动实时地校正漂移量, 实现了显微镜轴向9.93 nm的防漂移精度. 与现有商用的显微镜自带的防漂移装置相比, 防漂移精度提高了一个量级.     

超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术及其探测极限分析

理论上提出一种突破衍射极限限制的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法, 并对其探测极限进行分析.通过引入环形附加探测光与艾里斑周边的声子作用, 实现点扩展函数的改造, 提高相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统的横向空间分辨率. 随着分辨率的提高, 信号强度也随之降低, 尤其当应用于生物学、医学研究时, 样品分子数密度通常很低, 这将导致信号探测更加困难. 因此分析系统的探测极限, 确定超分辨体积元内的最小可探测分子数是展开超衍射极限相干反斯 托克斯拉曼散射显微成像实验研究的重要前提. 当泵浦光、斯托克斯光、探测光光强均达到极大值, 分辨率约40 nm三维空间内, 超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统的散粒噪声信噪比由曝 光时间与样品分子数密度决定. 曝光时间若取20 ms, 探测极限约为10³, 样品分子数目只有大于探测极限, 才能保证信号可以从噪声背景中提取出来. 关键词： 突破衍射极限 相干反斯托克斯拉曼散射 非线性光学 探测极限     

高效双螺旋点扩展函数相位片的设计与实验研究

双螺旋点扩展函数具有随离焦连续旋转变化的特性, 结合单分子定位方法可用于厚样品三维超分辨成像及分子定位追踪研究. 但双螺旋点扩展函数不足之处是光能利用率低, 对于光子数受限的荧光显微成像而言其应用受限. 本文通过对双螺旋点扩展函数在空域、频域和拉盖尔-高斯模式面等三个不同域中进行约束优化. 模拟结果表明, 优化后的双螺旋点扩展函数的光能效率提高了30多倍. 同时, 基于最优设计方案制备了相位片, 并实验验证了该设计的正确性. 与文献报道相比较, 本文结果在成像深度和光能利用率方面都有所改善. 关键词： 双螺旋点扩展函数 超分辨成像 轴向定位 优化算法     

双光子激发时间分辨荧光光谱测量技术

建立了一台基于高重复频率扫描相机的双光子激发时间分辨荧光光谱测量系统，能够同时测量样品的荧光光谱和寿命. 该系统的时间分辨率为6.5—200ps，光谱分辨率为1—3nm，能够实现快速数据采集以及可靠和可重复的寿命和光谱测量. 利用标准荧光染料(若丹明6G、香豆素314)及其混合溶液对该系统进行了测试，所得到的荧光光谱分布和寿命值与文献报道一致. 实验结果表明，该系统能有效区分多组分荧光团. 这为鉴别多荧光团或多组分生物组织提供了一种独特的对比方法，可用于多光谱分辨荧光寿命成像和荧光共振能量转移成像等方面. 关键词： 荧光寿命 荧光光谱 双光子激发 高重复频率扫描相机     

相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术研究

基于全量子理论对相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)过程进行了分析, 在此基础上搭建了单频CARS显微成像系统, 获得了不同尺寸聚苯乙烯微球高对比度的CARS显微图像. 为了标定成像系统的空间分辨率, 采用逐点扫描方式对直径为110 nm聚苯乙烯微球成像, 从而重构出系统的点扩展函数. 结果表明: 该CARS显微成像系统的横向空间分辨率约为600 nm, 而由阿贝衍射极限决定的理论空间分辨率约为300 nm. 分析了导致分辨率降低的原因, 并提出了解决方案. 为实现纳米分辨的CARS显微成像打下了坚实的基础.     

HeLa细胞突起中微丝束的纳米分辨荧光成像

在Matlab编程环境下模拟了单分子定位显微的纳米分辨成像,在传统实验参数条件下,对不同间隔分子带模型进行了模拟成像.模拟结果表明,单分子定位显微方法可以区分中心相隔20 nm的两个分子带.同时,也分析了不同像元大小对单分子定位精度的影响.此外,通过单分子定位显微方法在IX71倒置荧光显微镜上实现了纳米分辨,系统极限分辨率,即半高全宽为48 nm.在该系统上,获得了HeLa细胞突起中微丝束结构的纳米分辨图像.从重构获得的图像中可以看到微丝束的直径为75—200 nm.     

生物相容性量子点的表征及其在细胞标记中的应用

利用无机低温水相合成法制备表面包覆L-半胱氨酸的CdTe/ZnTe核壳型量子点,测量不同溶液以及激发功率激光作用下该量子点的光谱特性。结果表明,该量子点吸收谱和荧光光谱峰值位置不随pH值变化,而荧光光强随pH值升高呈近似线性上升趋势;不同缓冲液对该量子点荧光光强无影响,但随孵育时间延长,荧光强度略有下降;在强激光照射下QDs会被快速光漂白,选择适当的激光功率(<100 μW),可降低漂白速率,实现长时间稳定测量。因此,该量子点具有较好的生物稳定性和光稳定性,将其与血铁蛋白相连形成靶向共轭纳米粒,可成功用于HeLa细胞标记。细胞内量子点光漂白实验表明,细胞微环境会影响量子点的光稳定性,加速量子点的光漂白。     

超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术中空心光束的形成

空心光束的质量是超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术中决定成像质量的一个至关重要的因素. 本文基于菲涅耳衍射理论,分析了螺旋相位片法产生空心光束的物理机理,并且模拟了不同的入射条件对产生的空心光束的影响. 模拟结果表明:波长与相位片中心波长匹配且光强呈圆对称分布的高斯光垂直入射到相位片上,当高斯光束中心与相位片中心完全对准时,可获得较理想的空心光束;入射光光强分布的圆对称性以及入射光中心与相位片中心的对准程度都会影响产生的空心光束的强度分布;同时,高斯光束小角度倾斜入射时,空心光的强度分布仍呈圆对称,却在观察面发生一定的位移;此外,入射光中心波长偏离相位片中心波长不大时,对产生的空心光束的强度分布几乎没有影响. 上述分析结果对用于超衍射相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术中理想空心光束的获取具有重要的指导意义. 关键词： 空心光束 超衍射极限 相干反斯托克斯拉曼散射 螺旋相位片     

基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.