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新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae )菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF )的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F1、R1和F2、R2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF 和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF 与pET-gshF 。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF 后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF 用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL-1。 相似文献
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本研究的目的 是探讨2型糖尿病(T2DM)患者糖尿病足中,应用多层螺旋CT (MSCT)的诊断价值.选取T2DM患者130例,其中合并糖尿病足患者35例(Wagner分级0~2级22例,3~4级为13例,无5级),单纯T2DM患者95例,给予MSCT检查.结果 发现伴糖尿病足患者胫后动脉、胭动脉和股动脉截面积明显小于单... 相似文献
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稀溶液中光诱导辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)能够发生还原反应,但这一研究忽略了生物体细胞内因存在各种分子而高度拥挤的真实环境。本文采用紫外可见、荧光、同步荧光及圆二色光谱法,研究了大分子拥挤环境中光诱导HRP的还原过程及外界环境对其光还原的影响。UV-Vis光谱和同步荧光光谱结果表明,采用403 nm单色光照射时,HRP在拥挤试剂葡聚糖70(Dextran70)中还原程度较好,而HRP在聚蔗糖70(Ficoll70)拥挤环境下不发生光还原反应;采用280 nm单色光照射时,在拥挤试剂Dextran70和Ficoll70中HRP光还原反应程度增加,且HRP的光还原程度在Ficoll70溶液中远高于在Dextran70溶液中;光诱导HRP还原的最适温度在Dextran70和Ficoll70环境中分别为4 ℃和24 ℃;HRP在Dextran70溶液中的最佳光还原浓度是100 g/L,在Ficoll70环境中HRP还原程度随着Ficoll70浓度的增加而增大;CD光谱结果表明拥挤环境中HRP被光还原后,蛋白的二级结构基本没有变化。 相似文献
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γ-干扰素DNA传感器组装过程的表面等离子体子共振研究 总被引:4,自引:0,他引:4
自行设计并组装了一套简便实用的多波长表面等离子体子共振DNA传感装置,用于γ-干扰素DNA的检测。以人工合成γ-干扰素(interferongamma,IFN-γ)寡聚核苷酸片段作为DNA探针,用化学法标记生物素探针,利用生物素-亲和素系统相互作用在传感器表面固定DNA探针,使用该SPR传感装置实时监测了DNA探针的固定过程及DNA杂交反应的进行。用于IFN-γ寡聚核苷酸的检测,测定范围为50-400ng/mL;用于IFN-γ的聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增产物的检测,其测定范围为5-40ng/mL。同时研究了DNA传感器的稳定性、可逆性及干扰情况。实验结果表明,该传感器可成功地用于检测目的DNA。 相似文献
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本文研究了扁桃酸对映体在含二(2-乙基己基)磷酸(D2EHPA)与酒石酸衍生物复合手性选择剂的正辛醇-水两相体系中的萃取分配行为,考察了酒石酸衍生物的种类和初始浓度、D2EHPA的初始浓度、扁桃酸的初始浓度、萃取温度对分配系数和分离因子的影响.结果显示,复合手性选择剂能提高分配系数和分离因子,D2EHPA与D-酒石酸衍生物的复合手性选择剂与L-扁桃酸对映体比与D-扁桃酸对映体形成更稳定的非对映体复合物;且D2EHPA与二对甲基苯甲酰酒石酸(DTTA)的复合手性选择剂的手性选择性大于D2EHPA与二苯甲酰酒石酸(DBTA)的复合手性选择剂;同时,扁桃酸的初始浓度、萃取温度对分配系数和分离因子的影响较大. 相似文献
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通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae )菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF )的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F1、R1和F2、R2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF 和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF 与pET-gshF 。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF 后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF 用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL-1。 相似文献
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可分量子态能够写成乘积态的凸组合.通过可分量子态的可分表达式可以更好地理解量子态的数学结构.给出了一类多量子比特完全可分量子态的可分分解表示.此外,通过该类可分态的完全可分表示得到了一类阶数为2k的正交矩阵. 相似文献