肌酸激酶在胍溶液中的变性与失活速度的比较

本文以紫外差光谱、荧光光谱为监测手段测定肌酸激酶的变性与失活过程均为一级反应。在3M胍溶液中,30℃测得的失活速度常数为5.9秒~(-1),变性速度常数为1.9秒~(-1)。1M胍变性时,失活速度常数为4.3秒~(-1),而交性速度常数明显降低为0.04秒~(-1)。0.5M胍变性时,失活为两个一级过程,其速度常数分别为3.6秒~(-1)与0.003秒~(-1),此外酶还保持有3.4％的剩余活力;变性速度常数为0.004秒~(-1)。在0.3M胍中,酶的紫外差吸收及荧光变化都很小,但是60％的活力仍然迅速丧失,最后还保持有30％剩余活力。上述结果表明,酶的活性部位可能比较脆弱。酶分子双体的解聚或盐酸胍的抑制作用也可能引起酶的快速失活。低浓度胍变性时,失活过程的多相性意味着可能存在有部分活力的中间态。     

INTERMEDIARY OXIDATION REACTION BETWEEN THE TWO REDUCTION PHASES DURING THE TRIPHASIC COURSE OF CYTOCHROME b REDUCTION

The reduction of eytochrome b in the succinate-cytoehrome c reduetase by either succinate or duroquinol follows a triphasic course in the pH range 6.0—9.0. The rates of all the three phases of cytochrome b oxldation-reduction as well as the rate of reduction of cytochrome c increase with increasing pH. The course of both the triphasic changes and the multiphasic oxidation-reduction changes of cytochrome b in the presence of added cytochrome c have also been followed by repeated spectral scan at 4℃. In all cases, the reduction and oxidation of cytochrome b are clearly indicated by the appearance and disappearance of the 562 nm peak in the reduced minus oxidized spectra. The accumulation of ubisemiquinone at center i has been suggested to be responsible for the oxidation phase of cytochrome b.     

羧甲基D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照产生新荧光物质的研究——十二烷基硫酸钠的影响

对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶,无论是酶朊、羧甲基化酶朊,或经光照产生新荧光物的光照酶,在加入十二烷基硫酸钠(SDS)并扫描差吸收光谱时,均产生295nm及288nm两个负峰以及267nm的正峰,同样SDS也引起酶朊和羰甲基化酶朊的蛋白荧光淬灭,这些无疑都是由于原来位于酶蛋白内部非极性环境的色氨酸及酪氨酸残基转移到分子外部极性环境所致。新荧光物的形成对SDS非常敏感,在光照前加入SDS使其与酶的重量比为0.5时新峰的形成已经大为减弱,但与此同时其蛋白荧光却比上述对照样品为高,SDS对已经形成的荧光新峰的强度也有影响,但需要更多的SDS才能使新峰荧光强度有较明显的下降,在SDS与酶的比值约为0.5时,新峰荧光强度下降还不明显,但蛋白荧光强度却反而略有增加,这些结果表明,在酶分子内部的色氨酸侧链、NAD⁺以及活性部位巯基上的羰甲基之间的空间关系受到SDS破坏时,形成新荧光物的光化学反应就不能进行,在新荧光物形成之后,它与色氨酸之间的能量转移关系,也同样是对SDS敏感的。     

CHANGES IN CIRCULAR DICHROISM AND EXPOSURE OF BURIED THIOL GROUPS DURING DENATURATION OF RABBIT MUSCLE CREATINE KINASE

The denaturation of creatine kinase in guanidine solutions has been followed by both CD changes and the increase in rapid reacting SH groups. The rates of the exposure of SH groups axe in general agreement with the ultraviolet absorbance and fluorescence changes reported previously whereas changes in the ellipticity of the enzyme molecule can be detected at low guanidine concentrations before significant changes in the exposure of the aromatic residues could be observed. On the other hand, the rates of changes in the mean residue ellipticity at 220 nm are clearly slower than the changes in ultraviolet absorbance, fluorescence and exposure of SH groups. It is suggested that the secondaxy structure of the external regions of the peptide chains is affected at low guanidine concentrations followed by gross changes in the tertiary structure of the molecule resulting in the exposure of the buried aromatic residues. The destruction of ordered secondary structure of the peptide chain is a slower process than th     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性部位巯基与配体结合的关系

本文用荧光滴定、透析平衡和分子筛柱层析等方法对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下简称为GAPDH)与配体的结合进行了研究. 荧光滴定的实验结果,GAPDH酶肮与εNAD⁺结合为负协同性,如果酶的Cys-149巯基经碘代乙酸或四硫硫酸钠修饰后,则不仅酶与εNAD⁺结合减弱,并且其结合的负协同性也明显减弱.与此相应,εNAD⁺与酶蛋白结合后εA部分的荧光增强也不如未修饰酶那样明显.分子筛柱层析的结果指出,当酶的Cys-149巯基经化学修饰后,酶与ATP的结合能力也大大下降.这些结果都说明,酶活性部位Cys-149巯基不仅和酶与NAD⁺的菸酰胺部分的结合有关,它的修饰还直接影响到酶的腺嘌呤结合部位,从而影响到酶与配体结合的协同性质.荧光滴定和透析平衡的结果还表明,温度升高酶与εNAD⁺结合的负协同性增强,酶与ATP的结合则由非协同性变为负协同性.     

不同修饰剂对D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶产生新荧光物影响的研究

本文研究了GAPDH经不同修饰剂修饰后,光照能否产生新荧光物,其结果表明,酶经L-α-BPA、D-α-BPA、DL-α-BPPA及β-BPA修饰后,均和IAA修饰酶一样生成类似的荧光物。而经NEMI和O-IBA修饰的酶,却和经碘代乙酰胺和四硫硫酸钠修饰的酶一样,不能在同样条件下生成新荧光物,以上结果表明,在活性中心引入带羧基的基团是生成新荧光物所必需的。IASA和以上修饰剂都不相同,它和活性中心巯基反应后直接产生荧光。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶形成荧光NAD衍生物过程中的脱羧

本文证明兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶,经紫外光照射,形成荧光NAD衍生物的过程中发生脱羧。用[1-~(14)C]碘乙酸示踪此反应当荧光强度达最大值时,大约有一半的总放射性以二氧化碳的形式放出。用弱光源照射,可以观察到荧光衍生物的生成先于脱羧。嗜热脂肪芽孢杆菌酶,荧光NAD衍生物的生成为全位反应,并伴随有四分子二氧化碳放出。表明二氧化碳只能从形成荧光团的亚基上放出。控制实验条件,酵母酶四个活性部位的巯基可以全被羧甲基化,也可以仅有两个被羰甲基化。这两种酵母酶均形成两分子的荧光NAD衍生物,但二羰甲基酵母酶却只能脱去一分子二氧化碳。这一现象可能表示亚基间存在着构象的不对称性。     

羧甲基D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照产生新荧光物质的研究——色氨酸与新荧光发色团之间的能量转移

羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶在光照过程中形成的新荧光发色团,在325nm处有一平缓的吸收峰,它的位置和蛋白荧光有相当部份是重叠的,并且随着410nm荧光新峰的增强,蛋白荧光逐渐下降,这一结果说明酶蛋白部份的色氨酸残基与新荧光发色团之间存在着非辐射性的能量转移,我们对这一能量转移进行了测定并根据Fster公式计算了供受体之间的距离.由于在四聚体酶分子中,很可能只生成两个新荧光发色团,方向因子K~2采用供受体均能自由转动的数值,即K²=2/3,据此计算,供体色氨酸与新荧光发色团之间的距离为15.76。     

酵母羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶光照形成NAD荧光衍生物时的协同作用

本文表明与兔肌酶相同,活性部位巯基羧甲基化的酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶在NAD 存在下,经紫外光照,形成一发射峰为410毫微米的荧光衍生物。对于在四个活性部位中只有两个被引入羰甲基的酵母酶,也得到同样的结果。用蛋白内禀荧光淬灭方法测定这两种羧甲基酶,结合NAD~ 均为极微弱的负协同性,或几乎无协同性;但根据荧光衍生物形成的测定,两者却均为正协同性,这可能是由于NAD~ 和酶朊的结合方位在含荧光衍生物的酶中与天然酶中较为接近所致。     

醇脱氢酶和其它蛋白质光照产生新荧光物质的研究

前已报道羧甲基D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶在紫外光照射下生成发射峰为410毫微米的新荧光物.为了探讨这一现象是否具有普遍性,我们首先研究了酵母及马肝醇脱氢酶,发现醇脱氢酶在光照下也同样能生成荧光衍生物,但生成条件与荧光物性质都与甘油醛-3-磷酸脱氢酶不同.醇脱氢酶要求较强的光照,不需要活性部位巯基的羧甲基化也不需要NAD⁺的存在.所生成的荧光物的发射峰值为400毫微米.在光照过程中,醇脱氢酶迅速失活,同时320毫微米附近光吸收增加,半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及组氨酸则遭到部分破坏.对十余种蛋白质及多肽类物质进行紫外光照的结果,都能生成发射峰在395—400毫微米附近的荧光衍生物,说明紫外光照产生荧光物质是蛋白质的一种普遍性质.