反相液相色谱中计量置换线性参数logI的热力学特征

 依据液相色谱中溶质计量置换保留模型及线性参数logI(与1mol溶质对固定相的亲和势大小有关的常数),通过作图得知非极性和极性小分子溶质及生物大分子的logI与绝对温度的倒数1/T,以及小分子溶质的logI与其在正辛醇-水中分配系数的对数logPo/w呈线性关系,从两方面进一步证明了logI具有热力学平衡常数的性质。基于小分子溶质、生物大分子的logI和分配系数大小的差别,对两者在反相液相色谱中的保留对柱长的依赖关系给予了定量的说明。     

Mechanism of simultaneously refolding and purification of proteins by hydrophobic interaction chromatographic unit and applications

The hydrophobic amino acid residues of a denatured protein molecule tend to react with the particles of the stationary phase of hydrophobic interaction chromatography (STHIC). These hydrophobic interactions prevent the denatured protein molecules from aggregating with each other. The STHIC can provide high enough energy to a denatured protein molecule to make it dehydration and to refold it into its native or various intermediate states. The outcome not only depends on the specific interactions between amino acids, the structure of STHIC, but also depends on the association between the STHIC and mobile phase. The mechanism of protein refolding and the principle of its quality control by HPHIC were also presented. By appropriate selection of the chromatographic condition, several denatured proteins can be refolded and separated simultaneously in a single chromatographic run. A specially designed unit, with diameter much larger than its length, was designed and employed for both laboratory and preparative     

反相液相色谱中计量置换线性参数logI的热力学特征

依据液相色谱中溶质计量置换保留模型及线性参数 log I(与 1mol溶质对固定相的亲和势大小有关的常数 ) ,通过作图得知非极性和极性小分子溶质及生物大分子的 log I与绝对温度的倒数 1/T,以及小分子溶质的log I与其在正辛醇 -水中分配系数的对数 log Po/ w呈线性关系 ,从两方面进一步证明了 log I具有热力学平衡常数的性质。基于小分子溶质、生物大分子的 log I和分配系数大小的差别 ,对两者在反相液相色谱中的保留对柱长的依赖关系给予了定量的说明     

反相液相色谱中生物大分子保留自由能及相比的测定

依据液相色谱中溶质的计量置换保留模型（SDM-R）和反相液相色谱（RPLC） 中小分子溶质柱相比的热力学新定义,建立了准确测定生物大分子柱相比的理论模 型和实验方法,准确测定了生物大分子的柱相比。同时依据计量置换参数logI和Z 具有热力学平衡常数的性质,并以logI和对1/T作图呈线性为途径,解决了生物大 分子色谱热力学研究中存在的三个难题,准确测定了七种标准蛋白质在RPLC保留过 程中的自由能变,并发现在RPLC中柱相比对保留过程中溶质总自由能变的贡献值几 乎可与溶质在RPLC保留过程中的净自由能变相当。     

用疏水色谱法从猪心中快速制备高纯度的细胞色素C

提出了一种从猪心中快速制备高纯度细胞色素C的方法。使用一种装有大颗粒疏水填料的简易型疏水色谱柱在实验室规模对细胞色素C进行了纯化,通过反相色谱、紫外光谱及铁含量对样品的纯度进行了检验。与经典方法相比,此方法纯化工艺简单、操作时间短,细胞色素C的质量回收率高,纯度好。     

伴刀豆球蛋白亲和色谱柱的制备及其在糖蛋白核糖核酸酶B结构分析中的应用

通过对硅胶基质进行化学改性键合伴刀豆球蛋白(Con A),制备了对糖蛋白具有特异亲和作用的亲和色谱固定相;该固定相非特异性吸附弱,对于糖蛋白和糖肽的分离效果良好。对亲和色谱的分离条件进行了优化,以标准糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)为模型,对其进行了纯化;用糖苷酶切除糖链,并对切除糖链前后的RNase B用胰蛋白酶酶解;用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对亲和色谱分离得到的糖蛋白、糖链及糖肽进行了分析,确定了RNase B的一级结构、糖含量、糖基化位点及糖连接方式。该方法快速准确,适于糖蛋白和糖肽的分离表征。将其应用于血清中糖蛋白及酶解后血清中糖肽的分离富集,取得了很好的效果。     

嵌段共聚温敏亲和色谱固定相的制备及其对抗体的分离纯化

抗体药物在癌症治疗和免疫诊断中起着重要作用，但抗体的分离纯化通常采用酸性洗脱，易导致抗体聚集失活等问题。本研究以硅胶为基质，以温敏嵌段聚合物聚[(N-异丙基丙烯酰胺)-b-4-乙烯基吡啶](P[NIPAM-b-4VP])为间隔臂，以4-巯基乙基吡啶(MEP)为配基，制备了一种嵌段共聚温敏亲和色谱固定相SiO₂-P[NIPAM-b-4VP]-MEP,并以牛血清白蛋白(BSA)和γ-球蛋白为模型蛋白，对制备的温敏亲和色谱固定相的色谱性能进行了表征。分别考察了流动相盐浓度和温度对二者分离性能的影响。结果表明，在40℃时该固定相只选择性保留γ-球蛋白，而不保留BSA;在5℃时采用含0.6 mol/L NaCl的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲溶液进行洗脱，γ-球蛋白的质量回收率为92.7%。该固定相对γ-球蛋白的吸附量为(71.5±2.1) mg/g(n=3),是传统温敏亲和色谱固定相SiO₂-PNIPAM-MEP的2倍。将该固定相用于人血清中IgG的分离纯化，仅通过改变流动相温度和盐浓度即可一步实现对抗体的分离纯化，纯度大于97.4%±0.7%...     

用疏水色谱复性并同时纯化蛋白质的机理及其应用

变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有与疏水色谱固定相(STHIC)颗粒相互作用的倾向, 两者之间的疏水相互作用能够抑制变性蛋白分子间的相互聚集. 同时疏水色谱固定相还能在分子水平上给变性蛋白分子提供足够高的能量, 使其瞬时脱水并折叠成其天然构象或不同的折叠中间体. 变性蛋白在疏水界面上的折叠不仅取决于其氨基酸之间的特异性相互作用及疏水色谱固定相的结构, 而且还取决于固定相和流动相之间的协同作用. 同时, 还提出了高效疏水相互色谱(HPHIC)进行蛋白折叠的机理及其进行蛋白折叠时能实现质量控制的原理. 在适当的色谱条件下, HPHIC 可使几种变性蛋白一步实现复性及同时纯化. 此外, 还设计制造出了直径比柱长大得多的实验室型和制备型“变性蛋白复性及同时纯化装置, USRPP”, 该“装置”具有完全除去变性剂、使蛋白质复性, 与杂蛋白分离及易于回收变性剂的“一石四鸟”功能. 该“装置”对变性蛋白的复性和纯化效率与通常使用的长柱相当. 在制备规模情况下, 该“装置”可以在低压梯度条件下简便、快速、而经济地应用于重组蛋白药物的制备. 文中以重组人干扰素-γ为例, 说明了制备型“装置”在其复性及同时纯化生产工艺中的应用.     

Preparation of Medium Cation Exchange Stationary Phase of Polymeric Matrix and Their Chromatographic Properties

Based on the monodisperse poly（glycidyl methacrylate-co-ethylenedimethacrylate） beads （PGMA/EDMA） with macropore as a medium, a new hydrophilic medium cation exchange （MCX） stationary phase for HPLC was synthesized by a new chemically modified method. The stationary phase was evaluated with the property of ion exchange, separability, reproducibility, hydrophilicity, effect of salt concentration, salt types, column loading and pH on the separation and retention of proteins in detail. It was found that it follows ion exchange chromatographic （IEC） retention mechanism. The measured bioactivity recovery for lysozyme was （96 ± 5）%. The dynamic protein loading capacity of the synthesized MCX packings was 21.8 mg/g. Five proteins were almost completely separated within 6.0 min at a flow rate of 4 mL/min using the synthesized MCX resin. The MCX resin was also used for the rapid separation and purification of lysozyme from egg white with only one step. The purity and specific bioactivity of the purified lysozyme was found more than 95% and 70345 U/mg, respectively.     

用于变性蛋白质复性及同时纯化的简易型色谱柱的研制及其应用

研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察,该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱,但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率。另外,只要给该柱装填合适的固定相,比如疏水相互作用色谱固定相,便可用于蛋白质的复性及同时纯化。实验考察了该色谱柱的结构、操作和性能,包括柱压、柱寿命及对蛋白质的分辨率等。以溶菌酶为模型蛋白质,实验测得其在初始浓度为50.0 g/L时的质量回收率和活性回收率分别为(96.6±1.3)%和(101.1±6.0)%。这种简易型色谱柱价格低廉