β-伴大豆球蛋白的N-糖基化位点及其N-糖链的质谱分析

以β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)为研究对象,利用Trypsin和Pepsin酶对其进行水解,以Con A亲和层析柱富集纯化糖肽,并用糖苷酶PNGase F和Endo H分别酶解糖肽,再采用电喷雾质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对所得肽段的氨基酸序列及糖链的结构进行了分析,最后通过数据库检索对分析结果进行验证.结果表明,β-conglycinin具有5个N-糖基化位点,分别为α亚基的199和455位天冬酰胺(Asn),α'亚基的215和489位Asn及β亚基的326位Asn,且每个糖基化位点均被H5N2,H6N2,H7N2和H8N2这4种高甘露糖型N-糖链所修饰.本研究为各种糖蛋白的糖基化位点及其对应的糖链结构的鉴定分析提供了方法参考,并为深入理解大豆糖蛋白抗原表位的特异性及致敏机理提供了依据.     

荧光辅助糖电泳用于果胶水解产物中寡糖的分析研究

荧光辅助糖电泳(FACE)是首先用荧光衍生化试剂对糖类分子的还原端进行衍生化标记, 然后在一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离的分析方法, 可同时分析中性糖与酸性糖. 将该方法用于果胶寡糖的分离分析, 对影响FACE的诸多因素如荧光试剂的种类、用量, 荧光衍生化时间、温度, 分离胶浓度及盐、酸等进行了考察, 对果胶寡糖的FACE条件进行了优化, 结果显示: 每1.2 mg无酸且不含盐的果胶寡糖中, 加入0.2 mol/L的ANTS溶液3.75 μL, 1.0 mol/L的NaBH3CN溶液5 μL, 40 ℃衍生化反应16 h后, 在浓度为38%的分离胶上电泳分离, 取得良好的分离效果. 在该实验条件下, 果胶多糖酸水解后得到聚合度为2～16的果胶寡糖混合物, 与质谱分析结果基本一致. 该方法快速、简捷、灵敏、分辨率高, 费用低, 为果胶多糖可控性降解的监测和果胶寡糖的分离分析提供了技术手段.     

人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的O-糖链的比较分析

以培养的原发性肝细胞癌HepG2细胞和正常肝细胞L02为研究对象, 用细胞裂解液提取总蛋白, 然后采用Carlson还原性β-消除法释放O-糖链, 以阳离子交换柱结合C₁₈柱纯化分离O-糖链, 用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对O-糖链进行序列鉴定, 以β-环糊精为内标对2种细胞系的O-糖链进行定量比较分析. 结果表明, 在肝癌细胞系HepG2中检测到10种O-糖链, 正常细胞系L02中检测到9种O-糖链, 其中9种O-糖链是2种细胞系中共有的, 但HepG2中存在癌细胞中特有的缩短的O-糖链N1A1(NeuAc-GalNAc, sialyl Tn 抗原). t检验结果表明, HepG2与L02相比, 在检测到的10种O-糖链中有5种的含量具有极显著性差异(P<0.01), 2种的含量具有显著性差异(P<0.05).     

基于电喷雾电离质谱(ESI-MS)的苯胺稳定同位素标记对还原性寡糖(链)的定性定量分析方法

建立了一种基于电喷雾电离质谱的苯胺稳定同位素标记对还原性寡糖链进行定性及相对定量分析的研究方法. 用苯胺标记乳糖标准品, 优化了影响标记效率的各种因素, 在弱酸性环境下, 选择糖链/苯胺/硼氢氰化钠的摩尔比为1∶1.2∶10, 于70 ℃反应15 min即可标记完全; 同时考察了4对d0/d5苯胺标记的麦芽糊精寡糖在电喷雾电离质谱中的线性、动态范围以及重现性. 结果表明, 在15倍动态范围内, 相对定量方法呈良好的线性关系(R=0.9986)和重现性(CV=10.20%). 为进一步验证定量方法的可靠性, 将其应用于人奶中游离寡糖(HMOs)和牛奶中游离寡糖(BMOs)的分析. 研究结果表明, 人奶中的乳糖含量高于牛奶, 人奶游离寡糖比牛奶游离寡糖种类复杂, 且岩藻糖基化程度高. 该方法成本低廉, 标记效率高且后处理方法简单方便, 适于微量样品通量化分析, 对差异糖组的研究有重要意义.     

2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基氧化糖类物质伯羟基研究进展

2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)属于亚硝酰自由基类,能选择性氧化糖类物质的伯羟基,氧化产物的应用非常广泛。本文对TEMPO氧化糖类物质伯羟基的研究进展作一综述。     

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化寡糖链的HPLC分离及其激光解吸电离质谱分析

以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生化试剂对寡糖链进行标记, 用氨水替代氢氧化钠溶液作碱性介质, 衍生化反应后氨水可通过干燥除去, 省去了脱盐处理过程, 衍生化的寡糖可直接进行激光解吸电离质谱分析. 建立起了PMP衍生化寡糖的RP-HPLC分离分析模式, 在此HPLC分析条件下, 可以对标记的寡糖链进行样品分离及制备.     

A Sensitive Derivatization Method for the Determination of the Sugar Composition after Pre-column Reductive Amination with 3-Amino-9-ethylcarbazole （AEC） by High-Performance Liquid Chromatography

3-Amino-9-ethylcarbazole （AEC） was employed for monosaccharide derivatization. The derivatives can be analyzed by high-performance liquid chromatography （HPLC） with an ultraviolet detection （wavelength： 254 nm）. Monosaccharides were quantitatively derivatized with 3-amino-9-ethylcarbazole （AEC） at 70 ℃ for 60 min. The method was linear for all samples over the concentration range tested （r〉0.999）, the precision was found to be satisfactory （R.S.D. 〈 3%）, and the recovery ratios were 〉98.62%. The stability analysis showed R.S.D. was between 1.81%-3.16%. Detection limits for the samples （D-glucose, L-xylose, D-mannose, L-arabinose, and L-rhamnose） ranged from 0.06 to 1.97 ng/mL （S/N=3）. Under the optimized derivatization and HPLC conditions, five monosaccharides were well separated using a narrow bore C18 column （250 mm×4.6 mm） with 0.1 mol/L ammonium acetate containing 25% acetonitrile at a flow rate of 0.5 mL/min. As an application, the method has been successfully applied to the determination of monosaccharide compositions of three polysaccharides SPPA-1, SPPB-1 and SPPC- 1 of Spirulina platensis. This method also has potential application to oligosaccharide or glycan analyses.     

人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的Ο-糖链的比较分析

以培养的原发性肝细胞癌HepG2细胞和正常肝细胞L02为研究对象,用细胞裂解液提取总蛋白,然后采用Carlson还原性β-消除法释放O-糖链,以阳离子交换柱结合C18柱纯化分离O-糖链,用电喷雾电离质谱( ESI-MS)和串联质谱( MS/MS)对O-糖链进行序列鉴定,以β-环糊精为内标对2种细胞系的O-糖链进行定量比较分析.结果表明,在肝癌细胞系HepG2中检测到10种O-糖链,正常细胞系L02中检测到9种O-糖链,其中9种O-糖链是2种细胞系中共有的,但HepG2中存在癌细胞中特有的缩短的O-糖链N1A1( NeuAc-GalNAc, sialyl Tn 抗原). t检验结果表明, HepG2与L02相比,在检测到的10种O-糖链中有5种的含量具有极显著性差异(P<0.01),2种的含量具有显著性差异(P<0.05).     

花生致敏糖蛋白Ara h1糖链决定簇的质谱分析

以花生种子总蛋白及其主要致敏糖蛋白Ara h1为研究对象,采用"一釜法"对蛋白上的糖链进行释放并同时进行衍生化标记,通过C18固相萃取柱纯化,以电喷雾质谱(ESI-MS)、多级串联质谱(MSn)和亲水性液相色谱-质谱联用(HILIC-MS)进行结构解析和定量分析.结果表明,蛋白Ara h1共有10条N-糖链,其中7条为高甘露糖型,2条为木糖修饰,另外1条为与过敏原相关的核心α1,3-Fuc修饰N-糖链,其含量约占总糖链的12.45%.     

NRSF/REST蛋白结构域锌指9核磁共振溶液结构确定

NRSF/REST蛋白是神经元特异性基因表达的负调控因子. 其C端抑制结构域的C2H2型锌指结构域与共抑制蛋白CoREST相互作用能部分诱导NRSF/REST蛋白的负调控功能, 但具体的分子机制不清楚. 为了深入地研究该机制,利用核磁共振方法确定了该结构域C2H2锌指的溶液三维结构, 结果表明它具有典型的Cys2His2锌指三维结构, 揭示该结构域在NRSF/REST蛋白与DNA或RNA特异性识别上可能具有某些关键作用.