腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp.HUST-1发酵条件的优化

Rhodococcus sp.HUST-1在Co2+的诱导下产腈水合酶,催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺.对菌株HUST-1的产酶条件进行优化.研究表明,发酵过程中培养基中的碳氮源、诱导剂浓度以及培养条件影响腈水合酶的高效表达.在葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、Co2+0.08 mmol/L、酪氨酸0.2 g/L、pH7.0、培养温度28℃时,HUST-1所产腈水合酶总酶活达1 012.7 U,比优化前提高了47.1%.     

基于盐碱条件下产腈水合酶菌株的筛选与高酶活表达工艺的研究

利用含有一定比例丙烯腈和丙烯酰胺的特制培养基从新疆盐碱环境下筛选和分离产睛水合酶微生物,获得了具有在较高盐浓度和pH偏碱性条件下生长良好、菌苔为光滑、橙红、湿润的菌株。研究其细胞培养特性。通过对菌株的极端定向培育和产酶过程的研究,采用葡萄糖．诱导剂耦合补加工艺进行催化剂的制备,同时加入各种诱导剂进行产酶诱导。结果表明,pH=7．2,葡萄糖浓度维持在3-5g／L,发酵培养基中加入0．3％NH4a,0．6％丙烯腈,并在培养48h后加入0．3％丙烯腈,产生的脯水合酶酶活最高,可达8208．3U／mL。     

废弃菌体水解液作氮源发酵产腈水合酶的研究

工业生产中微生物细胞在发酵结束后常被作为废弃物丢弃,容易造成环境污染和资源浪费.对废弃细胞进行破壁处理,废弃菌体水解液可替代酵母膏作有机氮源用于发酵产腈水合酶.通过采用超声波、冻融、热碱3种方法破碎细胞,测定水解液中氨基氮含量的高低,确定选择热碱法为最佳细胞破碎方法.通过正交实验选出最优破壁条件为:N aOH加入量5g.L-1,水解温度100℃,水解时间1.5h.在最佳破壁条件下,细胞破碎液中氨基氮含量为24.5 g· L-1.并考察了酵母膏与水解液的不同配比对腈水合酶发酵酶活的影响,确定了酵母膏与废弃菌体水解液的最佳配比为3:2.实验结果表明:利用热碱法处理废弃菌体的水解液作为氮源部分代替酵母膏,发酵酶活为1 063万U·mL-1,而完全利用酵母膏作为氮源的发酵酶活为1 055万U·mL-1.     

反相高压液相色谱法测定恶臭假单胞菌腈水合酶活力

采用高压液相色谱法（ＨＰＬＣ）分析丙烯腈及其微生物酶法转化产物丙烯酰胺，配制两者的混合溶液做标准曲线，通过外标法定量，测定反应液中腈水合酶活力．实验结果表明，采用Ｎｏｖａ－ＰａｋＣ１８柱、以流速为１．６ｍＬ／ｍｉｎ的甲醇－水溶液（体积比２０：８０）作流动相、采用２１０ｕｍ紫外检测时两者分离度好．ＨＰＬＣ法与化学法相比具有准确、简单、快速、重现性好且灵敏度高等优点，适于批量样品的连续测定．     

腈水合酶产生菌Rhodococcuss p．HUST-1发酵条件的优化

Rhodococcus sp．HUST-1在Co^2＋的诱导下产腈水合酶,催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺．对菌株HUST-1的产酶条件进行优化．研究表明,发酵过程中培养基中的碳氮源、诱导剂浓度以及培养条件影响腈水合酶的高效表达．在葡萄糖20g／L、酵母粉10g／L、Co^2＋0．08mmol／L、酪氨酸0．2g／L、pH7．0、培养温度28℃时,HUST-1所产腈水合酶总酶活达1012．7U,比优化前提高了47．1％．     

腈水合酶产生菌的分离、鉴定及部分酶学性质研究

从长期被腈化物污染的土壤中筛选到一株腈水合酶产生茵YL-1，经过对分离菌株形态特征及生理生化指标的鉴定，该菌株初步鉴定为Rhodococcus．在含有丙烯腈的培养基中，细胞的生长与产物腈水合酶的合成相关，酶学性质研究表明：酶反应最适温度为30℃，最适pH为7．0．该酶在50℃以下，pH为6．0至9．0范围内较稳定。     

产腈水合酶优良菌种的选育及其在生产中的应用研究

本文通过出发菌株Nocardia.sp.163摇瓶发酵96h后分别向发酵液中间歇加入丙烯腈和催化生成高浓度丙烯酰胺分别对菌丝的毒害和耐受作用以及发酵液中残存菌丝涂布平板置于18℃低温培养成单菌落,筛选到一株比出发菌株Nocardia.sp.163相对腈水合酶晦活提高了76%的24号优良菌株.该菌株在催化腈水合生成丙烯酰胺的反应中,产酰胺酶酶活性比出发菌株降低了近50%;丙烯酰胺水溶液的电导率比出发菌株降低了45%,反应次数提高了3.33次,丙烯酰胺放料浓度提高了5.93%.     

腈水合酶在大肠杆菌中的表达纯化

微生物的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂,广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。实验先构建得到BL21-pGEX-4T-1/NHase重组菌,表达GST-NHase融合蛋白。由于GST的相对分子质量较大,阻碍了腈水合酶的β亚基与α亚基的正确结合,从而使腈水合酶表现不出酶活。于是又构建了BL21-pET-30c/NHase重组菌,IPTG诱导表达结果显示,腈水合酶α亚基基本没有得到表达,影响了腈水合酶的活性。经生物信息学分析发现,腈水合酶α亚基的起始密码子为gtg,可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别,于是通过点突变将gtg替换成atg,阳性重组子经IPTG诱导表达,结果显示腈水合酶β亚基和α亚基的表达量都有所提高。诱导表达的菌液经超声破碎,离心得到粗酶液,用EPI-30-ARG-IDA-Co2+亲和载体纯化带6×His tag的腈水合酶,气相色谱法检测腈水合酶的酶活达到200 U/mL。     

丙烯酰胺转化菌的分离筛选及其产酶条件

从腈纶厂污水处理系统的活性污泥中分离和筛选到一株丙烯酰胺转化菌.经初步鉴定,菌株T3属于红球菌属(Rlwdococcus sp.).对菌株T3产生腈水合酶的最适条件进行研究,结果表明,该菌株的最适产酶条件为培养基初始pH值7.5,培养温度35℃,培养时间72h,同时加入0.05g/L Co2+也会明显提高酶活性.在最适产酶条件下,菌株,13培养液的最高比酶活可达128.3U/mg,比优化前提高55.1%.     

一株腈水合酶产生菌的筛选、鉴定及培养条件研究

以葡萄糖为碳源,逐步增大培养基中丙烯腈浓度进行重复续代培养,从土样中筛选到一株腈水合酶活力较高的菌株.经形态观察和16S rDNA序列分析,该菌株鉴定为红球菌属(Rhodococcus)菌株,命名为Rhodococcus sp.TCCC 28001.对菌株TCCC 28001培养条件进行了初步研究,确定培养基为葡萄糖15 g/L,酵母粉5 g/L,尿素7g/L,Coz+10x10-5mol/L.28℃,180r/min培养72 h,腈水合酶活力达892 U/mL.     

丙烯腈水合酶反应动力学与酶失活动力学研究

在以丙烯腈为原料,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学,以自由细胞的酶为催化剂,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明,在这些因素中,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。经过对不同温度下的反应速度的研究,得到腈水合酶水合反应的活化能为昏60．87kJ／mol,酶失活反应的活化能为89．36kJ／mol。     

金属离子对红球菌腈水合酶活力的影响

不同金属离子对红球菌(Rhodococcus sp.)TCCC 28001的生长及其腈水合酶的酶活有着不同程度的影响.菌株TCCC 28001产生的腈水合酶是钴型,且Co2+对该腈水合酶诱导激活的最适浓度为10×10-5mol/L.选择酵母粉中含有且含量波动较大的5种金属离子,考察了在添加10×10-5mol/L Co2+诱导激活下,5种金属离子对酶活的影响.结果表明:Fe2+、Mn2+、Mo6+、Cu2+4种金属离子具有促进作用,Zn2+产生轻微抑制作用.6×10-5mol/L Fe2+的促进效果显著,使菌株TCCC 28001的酶活从453 U/mL增加到1941 U/mL,提高了328%.     

诺卡氏菌腈水合酶突变基因在重组大肠杆菌中的高活性表达

为了提高腈水合酶基因的重组表达水平,提出了3种基因策略:在重组大肠杆菌中共表达激活子序列、在重组毕赤酵母中表达以及对α亚基的起始密码子进行定点突变。结果表明:对α亚基的起始密码子进行定点突变的基因策略为最佳方案,突变后的腈水合酶基因在重组E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAM)中表达时,腈水合酶的比酶活(以干菌质量计)提高到51 U/mg。进一步以pET28a为载体,插入突变后的腈水合酶基因,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETNHM。对优选菌株进行培养条件和诱导条件的优化,腈水合酶的最高比酶活达到450 U/mg。