新型等点聚焦系统用于蛋白质组样本的预分离方法研究

对蛋白质或多肽的高效分离,将有利于降低肽段信号之间的干扰,保证规模化的蛋白质组学深度覆盖鉴定,并提高定量蛋白质组分析的准确性。本研究采用一种新型的等电聚焦预分离系统(OFFGEL),考察系统对293T细胞在蛋白质与肽段水平的分级分离效果,在OFFGEL系统中聚焦后的蛋白质或肽段可以从溶液中直接回收,与下游的LC-MS/MS肽段鉴定流程兼容。实验结果表明,肽段的分离效果明显优于蛋白质的分离,分级分离后各馏分对应的等电点位置与肽段的理论等电点分布高度一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例超过90%,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力,结合生物质谱技术,在293T细胞中实现6727个蛋白质的规模化鉴定,表明该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力。     

等电聚焦预分离用于肝癌细胞分泌蛋白质组的分级与鉴定

分泌蛋白质组(secretome)是指在特定的时空条件下,细胞、组织等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白质组可能包含了大量的疾病诊断生物标志物,因此其相关研究越来越受到重视。分泌蛋白质组的组成高度复杂且浓度范围宽,这对分析方法提出了挑战。建立有效的蛋白质或肽段预分离策略,将有利于分泌蛋白质的高覆盖率鉴定。本研究以肝癌细胞系MHCC97L的无血清培养分泌蛋白质为研究对象,采用一种新型等电聚焦预分离(OFFGEL)系统,考察了肽段水平的分级对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明,分离后各馏分中肽段的等电点分布与理论预测基本一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例接近80%,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力。结合生物质谱技术,在肝癌细胞分泌系统中鉴定了2995个蛋白质,显示了该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力。     

反相高效液相色谱双梯度洗脱分离肽混合物及质谱分析

复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。“鸟枪法”(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一。本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析。将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为: 与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3446.55～432905。该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景。     

亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质

建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明,第一维亲水作用色谱在碱性(pH 9.3)和第二维反相色谱在酸性(pH 3.3)的条件下,正交性最佳(R~2=0.34113)。在此基础上,结合馏分收集技术进一步评价了本测试系统在水稻叶片蛋白质分析中的正交性。结果表明,在所有馏分收集组分中,鉴定次数小于2次的水稻叶片肽段占总肽段数目的 50%以上,且一维液相色谱馏分收集的肽段在第二维色谱及质谱分离分析中,可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口,表明本研究建立的亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱结合馏分收集技术在复杂水稻叶片蛋白质分离鉴定中可提供良好的的分离正交性。结合水稻蛋白质数据库检索,共鉴定出207345个肽段,归属于2930个蛋白质簇。     

色谱研究的最新重要进展

细内径毛细管柱自由溶液用于分离宽范围DNA片段 凝胶电泳是分离DNA最高效的方法,但将凝胶注入微纳分离通道或细内径毛细管柱内存在很大的技术难度。为了克服这一技术难题,美国University of Oklahoma的Shaorong Liu和University of Texas at Arlington的P. K. Dasgupta等在无胶、无管壁改性和无外加电场的情况下,应用流体动力学原理在细内径毛细管柱上实现了宽范围 (75 bp ～106 kb)DNA片段的高效分离。他们还对分离后所采集的DNA片段的馏分进行了聚合酶链反应(PCR)扩增实验,发现采集的DNA片段保持了良好的扩增活性。(来源: J. Am. Chem. Soc., 2010, 132: 41－41) LC-MS/MS技术分离鉴定饮用水中的2,6-二氯-1,4-苯并醌 用化学试剂对饮用水进行杀毒处理是水处理中广泛采用的技术和方法,对于饮用水中致病菌的灭杀和防止流行病的发生具有重要作用。饮用水杀毒处理过程中的化学试剂有可能与水中的其他有机试剂发生反应,产生对人体具有毒副作用的副产物。加拿大University of Alberta的Feng Qin和Xingfang Li等发展了固相萃取样品预处理和LC-MS/MS的多级反应监测(MRM)的分离分析集成技术,对水中卤代醌的检测灵敏度达到3～8.7 ng/L。他们采用所发展的方法在饮用水中检测到由于化学试剂杀毒处理产生的副产物2,6-二氯-1,4-苯并醌,这是国际上第一次在饮用水中检测到2,6-二氯-1,4-苯并醌的报道。(来源: Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49: 790－792) 反相-反相二维液相色谱高效分离分析磷酸化肽的新方法 磷酸化肽的高效分离分析对磷酸化蛋白质组学研究具有重要的意义。多维色谱是实现磷酸化肽高效分离分析的最有效的途径。中国科学院大连化学物理研究所的叶明亮和邹汉法等发展了高正交性反相-反相二维液相色谱分离磷酸化肽的新方法。他们通过对分离流动相的优化,首先将富集的磷酸化肽混合物在高pH流动相下进行90 min的梯度分离,并在每1 min采集一个馏分,再将每间隔45 min的馏分混合(如1 min与46 min馏分混合,2 min与47 min馏分混合……),总计产生45个馏分。第一维分离的常规方法是每2 min采集一个馏分(0－2 min馏分,2－4 min馏分……), 90 min的梯度分离可采集45个馏分。在低pH流动相下采用毛细管反相液相色谱-质谱联用技术对第一维采集的馏分进行分离鉴定,发现第一维分离中将每间隔45 min的馏分进行混合的方式可以有效提高二维分离的正交性;与常规的每2 min采集一个馏分的方式相比较,磷酸化肽的鉴定能力提高了30%以上。他们将发展的方法应用于肝脏磷酸化蛋白质组的规模化分析,在将假阳性率控制在1%以下(即FDR＜1%)的条件下初步鉴定了8000个以上的磷酸化位点。(来源: Anal. Chem., 2010, 82: 53－56) 纳流通道分离阿升(Attoliter)级样品的飞升(Femtoliter)级液相色谱至今尚无良好的方法与手段对珍贵的极微量生物样品进行分离分析。日本University of Tokyo的Takehiko Kitamori等报道了飞升级液相色谱(fLC)的研究成果。他们在玻璃微芯片上制备了宽度和深度为几百纳米的纳流通道。该系统的尺寸只有常规液相色谱系统的1/1011左右,流动相的流量为亚pL/min,进样量为几百阿升。fLC无需分离固定相,可以分离电荷不同的化合物。fLC可以克服常规液相色谱分离固定相非均一性和涡流扩散的缺点。液相色谱尺寸的缩小不仅具有进样量小的优点,而且可有效提高分离效率。fLC可以应用于极微量样品(如单细胞样品)的高效分离分析。(来源: Anal. Chem., 2010, 82: 543－547) 全二维气相色谱-飞行时间质谱应用于化学武器前体痕量杂质的特征指纹分析 化学攻击作为潜在的恐怖活动正日益引起关注。美国University of Washington的Carlos G. Fraga等探讨了将样品分析和化学计量学相结合的方法用于化学攻击犯罪案件中法医鉴定的可行性。他们以一种有可能作为化学武器攻击的有毒试剂——甲基磷酸二甲酯(DMMP)作为模型化合物,以29种痕量杂质为检测对象,应用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF)对6批DMMP样品中的痕量杂质进行了指纹分析。进一步使用平行因子法(PARAFAC)对重叠峰进行数学分辨处理获得清晰的谱图,并通过与谱图库中标准谱图的比对成功地鉴定了检测到的化合物。通过对每一对样品的数据进行统计分析,结果表明其中5批DMMP样品中的痕量杂质化合物的含量有些很相近,有些存在一定的差异。而有2批DMMP样品中的痕量杂质则具有完全相同的指纹谱图。运用非负矩阵因子分析发现,DMMP样品由于得分值不同可以分为5类,其中有2个来自同一供应商的同一批样品不能实现区分,这是由于它们的痕量杂质含量相同造成的,而其他4个样品由于来自于不同批次或不同供应商而得到了很好的区分。这一结果表明可以通过痕量杂质的指纹分析有效追踪DMMP产品的来源。此外,他们还发现不同公司的某些DMMP样品存在特异性的痕量杂质分布。因此所发展的方法有可能成为化学攻击犯罪案件中法医鉴定可采用的有效手段。(来源: Anal. Chem., 2010, 82: 689－698)     

基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白的物种来源

建立了一种基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白物种来源的方法。样品经蛋白提取,还原,烷基化,胰蛋白酶消化后,采用Eksigent C18色谱柱(75μm×150 mm,3μm)分离,用流动相0. 1%甲酸水-乙腈溶液(98∶2)和0. 1%甲酸乙腈-水溶液(98∶2)梯度洗脱,在正离子模式下,通过纳升电喷雾四极杆飞行时间质谱进行检测,数据经Protein PilotTM软件及blast分析,筛选出潜在的特征肽段。消化后的样品再采用Eclipse Plus C18色谱柱(2. 1 mm×100 mm,1. 8μm)分离,用流动相乙腈和1%甲酸水溶液梯度洗脱,在正离子模式下,通过电喷雾四极杆/线性离子阱串联质谱的多反应监测触发增强子离子扫描模式进行检测,进一步确认肽段的特异性。最终筛选并确证了3种猪源性胶原蛋白特征肽段,4种牛源性胶原蛋白特征肽段,1种羊源性胶原蛋白特征肽段。所筛选的特征肽段具有良好的耐热性,可为动物源性胶原蛋白鉴定提供一种特异性强、准确可靠的检测方法。     

基于共价色谱分离的含半胱氨酸肽段富集策略

多维色谱分离、串联质谱分析技术已在蛋白质组研究中得到广泛应用。然而生物样品的蛋白质以及全酶切肽段具有高度的复杂性,这严重干扰了蛋白质高通量、规模化的分析。通过标签肽段富集进行样品预分离可以降低体系的复杂程度。本文建立了一种基于共价色谱技术选择性分离富集含半胱氨酸肽的方法,从而降低了样品体系的复杂程度。首先以牛血清白蛋白(BSA)的酶切肽段为模型,对富集条件进行了优化和考察,并在此基础上通过5种蛋白质酶切肽段混合物的富集对该方法进行了验证。结果证明此方法的重现性好,富集效率高,富集特异性好,能有效地富集鉴定含半胱氨酸肽段。所建立的方法在复杂体系的蛋白质组研究中具有广泛的应用前景,为复杂样品的蛋白质高通量、自动化、规模化鉴定和定量研究提供了实用技术。     

在线液相色谱-二极管阵列检测器-串联质谱法检测野生菌中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽

建立了在线液相色谱-二极管阵列检测器-串联质谱技术(LC-DAD-MS/MS)同时测定野生菌中多肽类蘑菇毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)的分析方法。样品经甲醇提取,水稀释后,在碱性条件下用XBridge~(TM) BEH C_(18)柱(150m m×3.0 m m,2.5μm)分离,并先后用DAD和MS/MS检测。使用碱性流动相能够实现5种多肽类蘑菇毒素在15 m in内达到基线分离,同时又能有效抑制质谱加钠峰[M+Na]~+的响应信号,保证检测的稳定性和灵敏度。5种蘑菇毒素在0.05~500 mg/kg范围内线性关系良好,相关系数(r)0.99;检出限为0.005~0.02 mg/kg。通过实际样品检测,证明该法操作简单、快速,灵敏度高,宽的定量检测线性范围能满足实际样品中蘑菇毒素含量变化大的特点。     

基于保留时间和质荷比匹配的液相色谱-质谱联用技术用于非标记肽段的差异分析

建立了一种无需化学标记的,基于纳升级毛细管液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术和质谱数据处理的肽段差异分析方法。本方法采用定量差异分析与肽序列鉴定分析分别进行的策略,首先对样品进行质谱全扫描的液质全谱式分析,在全扫描质谱数据中提取肽特征点信息,通过保留时间和质荷比参数匹配不同样品中的共有肽特征点,比较其相对峰强度有无差异。最后对样品中存在丰度差异的肽特征点进行选择性二级质谱分析和序列鉴定,从而实现复杂样品中肽段的差异比较分析。以血浆蛋白酶解混合物为实验对象,考察了本方法用于肽段相对定量分析的重现性以及浓度信号响应曲线等。结果表明:提取的肽特征点峰强度相对标准偏差的中值<22%,肽段离子强度动态范围达3个数量级,在5～1000fmol范围内对肽段定量具有良好线性关系。本方法可用于不同条件样品中具有倍数差异的内源性肽的比较分析。     

人神经母细胞瘤的磷酸化膜蛋白质组分析

针对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系的磷酸化膜蛋白质组,发展了基于多酶酶解法结合杂化硅胶基质固定化钛离子亲和色谱(Ti4+-IMAC)整体柱富集的分析策略。该方法通过对细胞裂解液进行超速离心,以及1 mol/L NaCl和0.1 mol/L Na2CO3顺序清洗,获得膜蛋白质组分。所提取的蛋白质分别经胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶平行酶解,产生的肽段经Ti4+-IMAC整体柱选择性富集磷酸肽后,采用纳升级反相液相色谱分离和质谱鉴定,成功鉴定到43个磷酸化蛋白质,其中有14个定位于膜上。研究结果表明,采用该策略开展SH-SY5Y细胞系磷酸化膜蛋白质组学分析有望加速对该肿瘤的研究和相关潜在标记物的筛选。