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双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence, TPEF)显微是一种非线性光学显微技术, 具有高的时间分辨率和空间分辨率、高的信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点. 传统的TPEF显微一般采用波长可调谐的超短脉冲激光器作为光源. 在实际应用中, 利用TPEF显微技术研究含有多种荧光团或未知成分的待测样品, 往往需要多次改变激发光的波长以获得对各种荧光团的最佳激发. 为了同时获取不同荧光团的荧光信号, 利用超连续谱激光光源实现了多色TPEF显微成像, 实验中无需调节波长, 能够同时获得具有两种不同发射波长的荧光标记的铃兰根茎切片样品的TPEF图像. 实验结果表明, 与传统的TPEF显微相比, 该方法能够同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度TPEF图像, 具有系统结构简单、操作简便、信息量大等优点, 在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景. 相似文献
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由于荧光寿命不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响,荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)在监测微环境变化、反映分子间相互作用方面具有高特异性、高灵敏度、可定量测量等优点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域.然而,尽管FLIM的发明和发展已历经数十年时间,其在实际应用中仍然面临着许多挑战.例如,其成像分辨率受衍射极限限制,而其成像速度与成像质量和寿命测量精度则存在相互制约的关系.近几年来,相关硬件和软件的快速发展及其与其他光学技术的结合,极大地推动了FLIM技术及其应用的新发展.本文简要介绍了基于时域和频域的不同寿命探测方法的FLIM技术的基本原理及特点,在此基础上概述了该技术的最新研究进展,包括其成像性能的提升和在生物医学应用中的研究现状,详细阐述了近几年来研究者们通过硬件和软件算法的改进以及与自适应光学、超分辨成像技术等新型光学技术的结合来提升FLIM的成像速度、寿命测量精度、成像质量和空间分辨率等方面所做的努力,以及FLIM在生物医学基础研究、疾病诊断与治疗、纳米材料的生物医学研究等方面的应用,最后对其未来发展趋势进行了展望. 相似文献
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拟威布尔分布密度函数在荧光寿命成像数据分析中的应用 总被引:1,自引:1,他引:0
荧光寿命法成像技术(FLIM)是一种非常有效、功能强大且能用来分析复杂生物组织和细胞分子的成像技术。传统的荧光寿命成像的数据分析,按某些具有不同寿命、离散的单参量指数模型来描述荧光衰减过程。在生物组织这样既复杂又不均匀的样品中,虽然多参量指数模型能提供比单参量指数模型对实验数据更好的拟合效果,但是离散多参量的假定往往是随意的。提出了拟威布尔分布密度函数可能是生物荧光分子团衰减动力过程的真实再现,并且通过计算证明,对于某些生化感兴趣的荧光分子团的多槽基面效价测定样品的数据,相对于单参量指数与多参量指数衰减函数有更好的一致性。同时讨论了将该荧光衰减模型应用于荧光寿命成像的前景。 相似文献
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双光子激发荧光成像技术对小鼠植入前胚胎的实时观测 总被引:3,自引:1,他引:3
双光子激发的蓝移效应可使利用同一束超快激光同时激发多种不同荧光特性的生物荧光染料的设想得以实现。选取锁模飞秒掺钛蓝宝石(Ti-sapphire)激光器输出的730nm激光,分别激发Hoechst33342,Fluo-4,PI和Indo-1四种常用生物荧光染料,分别利用(455±15)nm,(540±15)nm,(580±16)nm和(500±15)nm四种滤光片获得特异性荧光图像。结合双光子激发荧光成像技术穿透深,光损伤小,信噪比好等优势,选取合适的荧光染料组,应用单束激光激发、双染双通道成像方法,对小鼠植入前胚胎内细胞中的钙信号和染色体进行三维、四维实时成像,为探究小鼠植入前胚胎发育规律提供一种全新的多参数观测手段。 相似文献
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双光子荧光与相干反斯托克斯拉曼散射同属于三阶非线性效应,二者之间的差异与联系是一个值得研究的问题.本文基于自行搭建的超连续谱近红外宽带相干反斯托克斯拉曼散射显微成像系统进行光谱成像,同时通过理论与实验对比分析了双光子荧光与相干反斯托克斯拉曼散射图像存在差异的原因.结果表明,具有亚微米以上横向分辨率的相干反斯托克斯拉曼散射成像系统,可以使用较大尺寸的荧光珠进行双光子荧光成像,通过解卷积得到双光子荧光成像的系统分辨率,并将它近似等效于相干反斯托克斯拉曼散射成像系统的当下分辨率.如果需要得到相干反斯托克斯拉曼散射成像系准确的分辨率结果,就必须使用尺寸比相干反斯托克斯拉曼散射成像系统实际分辨率小的球形样品进行实验测量. 相似文献
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利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术,对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究,尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明,利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团,利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具,对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义.
关键词:
双光子激发荧光
荧光寿命成像
视网膜色素上皮层 相似文献
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利用一种基于时间相关单光子计数器的双光子激发荧光寿命显微成像技术,对猪眼底视网膜色素上皮层细胞内的脂褐素和氧化黑色素颗粒的空间分布及其荧光寿命特性进行了研究,尤其对于这些色素颗粒在光致氧化环境中的荧光寿命差异进行了分析.结果表明,利用荧光寿命测量能有效区分视网膜色素上皮层细胞中的多组分荧光团,利用荧光寿命的衰减参数可分辨正常及异常的荧光现象.该方法有望发展成为一种用于眼科临床诊断及病理学研究的高灵敏度的工具,对眼底细胞随年龄增长的衰老机理的研究具有重要的意义. 相似文献
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细胞是动植物结构和生命活动的基本单位.细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系.然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用.光学技术的快速发展,为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命... 相似文献
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利用像增强型CCD、氩离子激光器和氙灯等建立了一套快速荧光显微成像系统,并初步应用于活细胞研究。实时观测和拍摄了大鼠脑微血管内皮细胞增殖分裂过程中细胞内钙敏感荧光探针Fluo-3标记的钙离子浓度分布快速变化的图像,并选取动态图像中四个典型的点给出荧光强度灰度值的变化曲线。该系统可用于高灵敏实时记录活细胞内基于荧光显微成像的快速变化过程,为活细胞的研究提供了一种很好的观察和分析手段。 相似文献
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介绍采用双光子激发荧光方法进行单分子探测的原理和自行研制的实验装置,激发光聚焦和荧光收集采用共焦方式。选择香豆素C445水溶液作为研究对象,从样品流速、浓度、激光功率、信噪比和检测限等方面探讨了双光子激发荧光的特性。该谱仪目前己达到探测灵敏区内C445的平均分子数为1.5个的检测限 相似文献
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为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。 相似文献
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荧光辐射差分显微成像是一种荧光染料普适性强、光毒性较低的超分辨成像技术。然而传统荧光辐射差分成像由于受其成像原理限制,系统复杂度较高、稳定性低且成像速度受限。针对上述问题,本文设计搭建了一套多色虚拟荧光差分显微系统,并对该系统的成像方法和参数间的制约关系进行了分析,基于已有的多色虚拟荧光辐射差分显微术原理,进一步考虑了信噪比和背景噪声等的影响,建立了可通过实验验证的虚拟荧光辐射差分显微成像模型。实验表明,本系统与方法具有结构简单、背景去噪能力强、荧光染料普适性强以及光毒性低等特性,成像分辨率较共聚焦系统提升了1.9倍,成像速度较传统的荧光辐射差分显微系统提升一倍,在3个波长上均获得了良好的成像效果,并在生物细胞成像中得到实验验证。 相似文献