鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

一株H5N1亚型禽流感毒的分离鉴定与基因组序列分析

对一株于2005年从浙江省分离获得的禽流感病毒株（A／Chicken／zhejiang／24／2005）进行了鉴定、全基因组序列测定、分析和致病性研究．经血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验证实，此分离病毒株为H5NI亚型．对该毒株的全基因组序列测定和分析显示，HA蛋白在HA1和HA2连接处，含有连续多碱性氨基酸模体（-RRKKR-）．进化分析结果表明，A／Chicken／zhejiang／24／2005（H5N1）7个基因来源于2004～2005年湖南地区流行株，但PB1基因来源于未知野禽毒株．动物实验结果显示，Ck／ZJ／24／05对鸡和鸭均具有高致病性，对小鼠无致病性，与HA的序列特征相符合．     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶的表达及抗体制备

以禽流感病毒A／chicken／Hubei／489／2004（H5N1）NA基因全长eDNA克隆pMD-NA为模板，PCR扩增第406位至第1353位基因片段。克隆到pET-28a表达载体，构建重组质粒pET-28／ANA，转化大肠杆菌，用异丙基口硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE和Western blot分析证实，截短的NA重组蛋白获得高效表达。采用SDS-PAGE纯化重组蛋白，免疫家兔，制备特异性神经氨酸酶（NA）抗体。ELISA及间接免疫荧光检测结果显示，该抗体效价在1：1×10^5以上，能与在大肠杆菌和Vero细胞中表达的NA蛋白产生特异性反应。纯化的NA重组蛋白可用作建立禽流感检测方法的诊断抗原，所制备NA抗体可用于检测禽流感基因工程疫苗中的NA抗原组分。     

一株鸭细小病毒的分离鉴定与ns基因序列分析

采用余姚某鸭场濒死鸭肝组织悬液，接种鸭胚尿囊腔增殖病毒，蔗糖梯度离心法纯化病毒，电镜观察见直径约20nm的球形病毒粒子，免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒（duck parvovirus，DPV）抗血清有明显沉淀线；SDS-PAGE电泳可见3条结构蛋白带，与DPV毒株一敛；参照GenBank DPVns基因序列979～1566bp设计引物，PCR扩增反应获得其目的片段．克隆到载体pMD18-T后测序，该序列与GenBank中的番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）以及巴比里鸭细小病毒（Barbarie duck parvovirus，BDPV）的ns基因序列同源性为98％．病鸭肝组织匀浆液雏鸭感染试验显示雏鸭发病症状及剖解病理变化明显，死亡率为75％．利用血清学实验与鸭肝炎Ⅰ型、禽流感和新城疫病毒感染举别．由此确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV，命名为04NY株．