带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒——一种可能的乙型肝炎活疫苗

我们组建了带有痘苗病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的痘苗病毒载体,并将乙型肝炎(以下简称乙肝)表面抗原(HBsAg)基因(adr亚型)插入载体质粒,置于痘苗病毒早期启动基因的调控下。通过感染与转染相结合的方法,得到了带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒。它保持了原有的感染性,并能有效地表达乙肝表面抗原。当病毒接种量为每个细胞1PFU(空斑形成单位)时,每1×10~6细胞感染后24h可产生2—3μg HBsAg,其中大部分释放于细胞培养液中。每升培养液可以产生0.5—1mg HBsAg。表达产物HBsAg能形成颗粒,其大小、浮力密度,多肽组份等都与病人血清中的HBsAg颗粒相同。用重组痘苗病毒免疫家兔,可以产生抗乙肝表面抗原的专一性抗体。实验结果表明,利用本文组建的重组痘苗病毒不仅可以提供一个生产乙肝表面抗原的系统,而且这种重组痘苗病毒就可作为活疫苗使用,来预防乙肝病毒感染。     

Gene Amplification and High-Level Expression of Human Pro-Urokinase cDNA in Chinese Hamster Ovary Cells

Human Pro-Urokinase (Pro-UK) is expressed in CHO-DHFR- cells at high efficiency by co-transfecting the mouse dhfr gene and Pro-UK cDNA under the control of the SV40 late promoter. After gene co-amplification, the product level could reach 2-3 μg/106 cells/24 h in the presence of 5×10-6 mol/ L MTX, and the levels can be further raised to 3. 5-4 μg/106 cells/24 h by PMA superinduction. The copy number of Pro-UK cDNA in the genomes of host cells is about 200-300 copies/cell. The Western blot analysis shows that the recombinant Pro-UK has similar molecular weight to its natural counterpart, and also the amidolytic activity of the product is determined by S-2444 assay.     

带有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体的构建及其在离体细胞中的高效表达

报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d~(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d~(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。     

IL-24重组载体的构建及其联合化疗药物对SKOV3细胞中TUBB3与ERCC-1基因表达的影响

通过基因重组技术将白介素24(IL-24)基因片段分别克隆成pc DNA3.0-OSP-1-IL-24和pc DNA3.0-IL-24载体,利用逆转录PCR(RT-PCR)测定2种载体的表达.将2种化疗药物紫杉醇(PTX)与顺铂(DDP)分别作用于正常SKOV3细胞及pc DNA3.0,pc DNA3.0-IL-24,pc DNA3.0-OSP-1和pc DNA3.0-OSP-1-IL-24稳定转染SKOV3细胞(卵巢癌细胞株),通过噻唑蓝(MTT)法检测化疗药物联合IL-24基因对细胞的杀伤效果及细胞的增殖能力,应用实时荧光定量PCR技术检测人β-微管蛋白3(TUBB3)与核苷酸切除修复交叉互补基因位1(ERCC1)基因在各组细胞中的表达.RT-PCR检测结果显示,通过基因重组技术克隆了pc DNA3.0-IL-24与pc DNA3.0-OSP-1-IL-24载体,IL-24基因能提高SKOV3细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇的敏感性.其联合化疗药物对肿瘤药物的IC50值分别下降了10倍和6倍,TUBB3和ERCC1基因在IL-24基因转染的SKOV3细胞内的表达水平与在正常SKOV3细胞内相比,分别下降4倍和10倍多.上述结果表明,IL-24联合化疗药物可明显下调TUBB3与ERCC1基因的表达,该实验为临床治疗卵巢癌提供了重要的理论依据.     

在昆虫细胞中克隆与表达人白细胞介素6

本文利用DNA合成及PCR技术对人白细胞介素6(hIL-6)cDNA进行转译优化与扩增,并同杆状病毒载体pVL 1393重组构建了pVL·IL-6载体;通过磷酸钙共沉淀法将pVL·IL-6 DNA与野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(wtAcMNPV)DNA共转染昆虫细胞Sf9,筛选出表达人IL-6的重组病毒rAc·IL-6,经ELISA定量测定rhIL-6表达水平约为1μg/ml;rhIL-6生物活性经IL-6依赖细胞系7TD1测定为10~6u/ml。     

流动注射停流-催化光度法测定环境水样中痕量Mn(Ⅱ)的研究

在碱性介质中,Mn(Ⅱ)对催化KIO4氧化镁试剂Ⅰ(对硝基苯偶氮间苯二酚)的褪色反应有显著作用。据此建立了测定痕量Mn(Ⅱ)的流动注射停流-催化光度法。优化了流动注射条件,Mn(Ⅱ)在2~10μg/L,10~160μg/L,160~1000μg/L范围内符合比尔定律,采样频率6样/h,检出限0.12μg/L,相对标准偏差(RSD)4.9%(n=6)。用于环境水样中Mn(Ⅱ)的检测,回收率为95.5%~102%。     

带有人Ⅸ因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达

本文报道对血友病B实施基因治疗的可能性,首先将由SV40早期启动子,小鼠MT-1启动子和反转录病毒LTR启动子控制的Ⅸ因子cDNA构建到反转录病毒载体,然后用电穿孔法将构建的4个反转录病毒载体分别转入一株Amphotropic辅助细胞,PA317细胞,再用一株人纤维肉瘤细胞,HT1080细胞,测定这些辅助细胞的产病毒滴度,可得到2×10~4CFU/ml到5×10~5CFU/ml左右的病毒感染颗粒,用ELISA分别测定转有不同病毒载体的PA317细胞的Ⅸ因子蛋白产量,发现LTR启动子的表达效率最高,Ⅸ因子蛋白的分泌速率可达584ng/10~6细胞/24h,而SV40早期启动子和MT-1启动子的表达效率分别只有它的1/10和1/20,将表达效率最高的反转录病毒载体pXL—Ⅸ 1转入一株取自血友病B患者原代培养的皮肤成纤维细胞后同样能产生较高浓度的Ⅸ因子蛋白,其分泌速率可达549ng/10~6细胞/24h,其中75％以上的Ⅸ因子具有凝血活性,从而达到了首先在体外培养细胞纠正Ⅸ因子基因缺陷的目的,实现了血友病B基因治疗的第一步。     

小鼠早期胚胎肢体发育中的视黄酸诱导的视黄酸代谢

给怀孕10 d的小鼠胃灌流视黄酸(100 mgRA/kg体重)6和24 h后,对视黄酸合成酶基因Raldh2和代谢酶基因Cyp26a1,Cyp26b1在胚胎肢体的表达进行了分析.Cyp26a1和Cyp26b1在灌流6 h,表达增加;灌流24 h,表达恢复到正常水平.Raldh2在此时间段表达降低.这些结果提示:在小鼠早期胚胎肢体发育中,存在视黄酸诱导的视黄酸代谢.     

超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定食品中34种非法添加减肥类化合物

建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱测定食品(含保健食品)中34种减肥类非法添加化合物的方法。采用Waters CORTECS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm),以0.1%(v/v)甲酸水溶液-含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,在电喷雾离子源、正离子或负离子模式下以多反应监测(MRM)方式检测。西布曲明等29种化合物在0.5~10μg/L范围内、氯噻嗪等5种化合物在2.5~50μg/L范围内均呈良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.99;西布曲明等29种化合物在5、10和20μg/kg添加水平下的平均加标回收率为49.2%~136.2%,相对标准偏差(RSD)为0.7%~15.0%(n=6),氯噻嗪等5种化合物在25、50和100μg/kg添加水平下的平均加标回收率为51.5%~130.9%,RSD为0.8%~14.0%(n=6);西布曲明等29种化合物的检出限为5μg/kg,定量限为10μg/kg,氯噻嗪等5种化合物的检出限为25μg/kg,定量限为50μg/kg。本方法已应用于实际样品的测定,共检出了12种化合物,有效打击了非法添加行为。     

电脉冲介导的基因转移——哺乳动物细胞的瞬间表达和稳定转化

本文使用电脉冲介导的基因转移技术,研究外源基因在哺乳动物细胞中的表达,结果成功地将Px1TK质粒,PSV2Neo质粒和含有人膀胱癌基因的PUCEJ质粒分别导入MLTK~-细胞和NIH/3T3细胞。获得了MLTK~-细胞的瞬间表达和稳定转化;NIH/3T3细胞的稳定转化和恶性转化。瞬间表达率达80％,稳定转化率约10~(-4)。用分子杂交检测外源基因在转染细胞中的整合情况以及裸鼠接种检测恶性转化细胞的致瘤性,均获得了阳性结果。     

催化光度法测定痕量猛——高碘酸钾-Mn(Ⅱ)-邻菲啰啉-溴酚蓝体系

本文以高碘酸钾-溴酚蓝为指示反应,在活化剂邻菲(口罗)啉存在下建立了催化光度法测定痕量锰(Ⅱ)的新方法,方法灵敏度为6×10~4μg/ml。线性范围为0.00—0.60μg/15ml,应用于标准铝合金及茶叶中痕量锰的测定,结果令人满意。     

在GAL-10启动子控制下HBsAg基因在酵母中表达

本文运用既能在E。Coli又能在酵母Saccharomyces cerevisiae中复制的杂合质粒YEP51,与乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原基因进行重组。重组质粒pGHBs-1在酵母中使表面抗原基因在GaL-10启动子控制下得到表达,表达产物聚合成颗粒状,其大小和形状与病人血清中的表面抗原蛋白相似,100ml培养物约能产生1μg表面抗原蛋白。     

UPLC法同时测定注射用丹参(冻干)中6种酚酸的含量

建立同时测定注射用丹参(冻干)中丹参素钠、原儿茶酸、原儿茶醛、异阿魏酸、丹酚酸G和迷迭香酸6种酚酸类成分含量的UPLC法。采用ACQUITY UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8μm)色谱柱,流动相为0.1%甲酸(A)-乙腈(B)系统梯度洗脱(0 min,100%A;0~5 min,0%B~8%B;5~10 min,8%B~20 B;10~20 min,20%B~45%B;20~24 min,45%B~100%B;24~25 min,100%B~100%A;25~30 min,100%A),流速0.3 mL/min,柱温30℃,检测波长254 nm。结果显示6种酚酸类成分在一定范围内(丹参素钠101.5~1624.0μg/mL、原儿茶酸0.846~13.540μg/mL、原儿茶醛82.60~1321.60μg/mL、异阿魏酸5.01~80.16μg/mL、丹酚酸G 8.97~143.52μg/mL、迷迭香酸8.67~138.72μg/mL)线性关系良好(r=0.9990~0.9998),平均加样回收率在95.1%~102.9%范围内,RSD均小于3.0%。该法经验证准确可靠,可用于该制剂中6种酚酸的含量测定,为其多成分质量控制提供了科学依据。     

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3~+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3~+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.     

应用电注射法将外源基因导入水稻种胚及获得转基因水稻植株研究

用我们实验室自制的电容放电式电激仪,成功地把质粒pLGVneo2103上的NPTⅡ基因导入两个水稻品种(籼稻品种三二矮和粳稻品种农虎6号)的种子胚细胞中,在含有100μg/ml Km的MS培养基上选择出抗性愈伤组织,并由此通过体胚发生途径再生出转基因植株,NPTⅡ检测和DNA分子杂交证实外源基因已在上述转化体中得以稳定的整合和表达.     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.     

带肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白性质的研究——形成表面抗原颗粒和在不同细胞中的分泌

我们用定向缺失突变和体外重组法构建了含有肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(S蛋白)基因。该基因在猴肾细胞COS-M6中的表达产物(S309蛋白)能形成表面抗原(HBsAg)颗粒并分泌出细胞。它在细胞和培养液中稳定,并能分别被抗HBsAg和抗preSl区的抗血清所沉淀。CsCl密度梯度分析显示S309蛋白形成颗粒的密度比S蛋白略大(1.25g/ml)。S309蛋白在肝癌细胞株中容易分泌,分泌量和S蛋白相近。但它在COS-M6细胞中的分泌和肝细胞株相差悬殊,分泌量只有10％左右,而且在培养液中出现较迟。和S蛋白的同时表达则能明显地提高它的分泌效率。     

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中螺虫乙酯及其代谢物残留

建立了超高效液相色谱-串联质谱快速测定牛奶中螺虫乙酯及其代谢物残留的分析方法。牛奶经乙腈沉淀蛋白质,正己烷脱脂后,采用ESI源,在MRM模式下测定螺虫乙酯及其代谢物。结果表明,在0.5~50μg/L范围内,待测物色谱峰面积与其质量浓度间的线性关系良好(相关系数均大于0.998),检出限(LODs,S/N=3)和定量限(LOQs,S/N=10)分别为0.05~0.30μg/L和0.17~1.00μg/L。当添加水平为1.0、2.0和10μg/L时,方法的加标回收率为80.0%~108.8%,相对标准偏差(RSD)为4.8%~15.2%(n=6)。该法快速,灵敏,准确,能够满足牛奶中螺虫乙酯及其代谢物残留限量的检测要求。     

UPLC-MS/MS法同时检测番茄与黄瓜中的24种杀虫剂

建立了超高效液相色谱-串联质谱检测番茄和黄瓜中24种杀虫剂残留的分析方法。样品用乙腈提取,经QuEChERS方法净化,高速离心,过滤膜后以超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测。结果表明:在0.1~50μg/L质量浓度范围内,24种杀虫剂线性良好,相关系数(r2)大于0.99;在0.002、0.01、0.1、1.0 mg/kg 4个加标水平下,24种杀虫剂在番茄和黄瓜中的平均回收率为70.3%~110%,相对标准偏差(RSD)小于15%;方法的定量下限(LOQ)为0.05~5μg/kg,检出限(LOD)为0.01~1.82μg/kg。方法的定量下限和检出限均符合检测要求。该方法具有高灵敏度、高准确度和高效率的优点,适用于番茄和黄瓜中24种杀虫剂的同时检测。     

聚合酶链反应用于高效的基因改造

本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99％以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。