酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成

本文报道采用有机合成与酶促合成相结合的方法,按照R.Holley等测定又经他人修正的一级结构,人工全合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的工作。我们合成的tRNA_y~(Ala)与天然的tRNA_y~(Ala)具有相同的化学组成(含有全部修饰核苷酸)和结构,并有完整的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,能接受丙氨酸,而且在兔网织红细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去。在进行全合成以前,曾分别进行了两种人工半合成,即将天然的5′半分子与人工的3′半分子和人工的5′半分子与天然的3′半分子进行连接,都取得有生物活力的整分子tRNA_y~(Ala)。据我们了解,这是世界上第一次用人工方法合成的具有生物功能的核糖核酸。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子(36—76)的合成

本文报告用T_4RNA连接酶将相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))3′-半分子(36—76)的三个寡核昔酸大片段——10(36—45)(Ⅰ),12(46—57)(Ⅱ)和19p(58—76)(Ⅲ)——从3′-端向5′-端延伸逐个连接合成了这个tRNA的3′-半分子(36—76)。首先在供受体配比为1:1.5的情况下,采取三步连续反应,即19p(Ⅲ)的5′-磷酸化,然后与12(Ⅱ)的连接和连接反应产物的5′-磷酸化等反应,一次制备分离的方法,以70％的总得率合成了5′-磷酸化的三十一核苷酸(46—76)(Ⅳ)。然后,以(Ⅳ)作为下一步反应的供体和三倍量的10(Ⅰ)连接,以67％的产率合成了具有四十一核苷酸的tRNA_y~(Ala)的3′-半分子(36—76)(Ⅴ)。将这个合成的3′-半分子,5′-磷酸化以后,与天然的5′-半分子连接,人工半合成了tRNA_y~(Ala)整分子,经生物活力测定,这个人工半合成的tRNA_y~(Ala)具有接受[~3H]-丙氨酸、并能将接受的丙氨酸转移到蛋白质分子中去的生物活力。     

修饰核苷酸的生物功能——Ⅱ.酵母tRNA~(Ala)类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))的合成及生物活性

酵母tRNA~(Ala)的5′-半分子类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))与3′-半分子在T_4 RNA连接酶催化下连接成酵母tRNA~(Ala)类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))的整分子。合成的酵母tRNA~(Ala)类似物,在凝胶电泳上具有与天然酵母tRNA~(Ala)相同长度位置,其纯度为95％左右,连接点、末端分析都是对的。测定了这类似物的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,接受丙氨酸的能力与天然重组的酵母tRNA~(Ala)没有明显变化,而在兔网织细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去的能力,A_(34)代替I_(34)的只有天然或天然重组酵母tRNA~(Ala)的1/3,而G_(34)代替I_(34)的为90％左右。着重讨论了A或G代替I_(34)后,参入活力变化不同的原因。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子(1—35)的合成

本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75％,三十五核苦酸的连接率是90％,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21％。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。     

酵母丙氨酸tRNA类似物的合成及其生物活力的测定

在体外系统中,T 7-RNA聚合酶转录编码酵母丙氨酸tRNA及其半分子的DNA,获得不含修饰核苷酸的酵母丙氨酸tRNA及其5’半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸).在T4-RNA连接酶的催化下,不含修饰核苷酸的5'半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸)分别与天然的3'半分子(36-75位核苷酸)和5'半分子(1-36位核苷酸)连接成tRNA类似物.用以上方法得到了酵母丙氨酸tRNA的3个类似物:(1)tRNA的5'半分子不含修饰核苷酸;(2)tRNA的3'半分子不含修饰核苷酸;(3)整个tRNA分子不含有修饰核苷酸.在鼠肝氨酰tRNA合成酶系统中测定tRNA接受丙氨酸的活力,在兔网质无细胞蛋白质合成系统中测定tRNA将丙氨酸参入蛋白质的活力.结果是:5'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低52％,而参入丙氨酸的活力基本不变;3'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低79％,参入活力降低57％;整个分子不含修饰核苷酸者接受丙氨酸的活力降低85％,参入活力降低47％.这些结果说明修饰核苷酸,尤其是3'半分子的修饰核苷酸与tRNA的接受活力和参入活力间有密切的关系.     

tRNA分子中修饰核苷酸的生物功能——Ⅲ.酵母tRNA类似物(A_(37),G_(37)或C_(37)代替m~1I_(37))的合成及生物活性

本文报道用牛脾磷酸二酯酶在控制条件下制备了去除37位m~(?)I的酵母丙氨酸tRNA3′-半分子(38—76核苷酸)。合成了由普通碱基A,G或C代替m~(?)I_(37)的酵母丙氨酸tRNA类似物。并测定了这些类似物的生物活性,结果表明与天然的酵母丙氨酸tRNA相比,这些类似物在鼠肝tRNA合成酶系统中接受丙氮酸的活力不受影响,而在兔网织蛋白质合成系统中携带丙氨酸参入蛋白质的活力却下降为天然tRNA的20—30％,对上述结果及牛脾磷酸二酯酶的作用条件进行了讨论。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸双氢尿核苷(D)环区九核苷酸(14-22)的合成

用有机合成或酶促合成的AGDCGG为受体,以过量的pDAGp为供体,应用T_4RNA连接酶,成功地合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的双氢尿核苷(D)环区九核苷九磷酸AGDCGGDAGp.在脱去3’-端磷酸基团后,得九核苷八磷酸.产物经序列分析证明,与AGDCGGDAG完全符合.本文也进行了相应于D环区九核苷酸的组成片段AG,AGDC,GG,GGp和DAG的5’-磷酸化和它们之间连接的条件探索,发现了3’-DMP和DAG的5’-磷酸化需在5～10℃下进行,可获近定量的产率. AGDCGGDAGp已用于tRNA_y~(Ala)的全分子合成.     

天花粉胰蛋白酶抑制剂及其类似物的全合成

天花粉胰蛋白酶抑制剂(Trichosanthes trypsin inhibitor, TTI)是一含27个氨基酸残基的多肽,其中包括三对硫硫键。本文报道了它的化学全合成及其分子内二硫键重组,合成产物纯化后其氨基酸序列以及与胰蛋白酶的抑制当量比均与天然抑制剂相一致。并合成了此抑制剂的类似物,其N端第6位Met残基由Ala所取代,合成产物纯化后,其抑制活力也与天然抑制剂相同。此结果为今后天花粉胰蛋白酶抑制剂作为融合蛋白用基因工程表达以及产物的后处理提供了依据。     

核酸化学研究 Ⅴ.修饰的核苷酸和寡核苷酸的合成

本文叙述的修饰核苷酸——假尿嘧啶核苷酸的合成以及它和胸腺嘧啶核苷酸的保护,酵母丙氨酸转移核糖核酸TψC臂中CpCpGpG和TpψpCpG的合成.CpCpGpG和TpψpCpG均已圆满地用于t-RNA_y~(Ala)的3'-半分子合成和整分子的全合成.     

(±)-Hongoquercin A全合成:可见光促进有机催化多烯环化策略

报道了天然产物分子(±)-Hongoquercin A的仿生全合成路线.作者最近开发了在可见光促进下以染料分子曙红为光敏剂的自由基多烯环化反应.以此为基础,将该方法学应用于(±)-Hongoquercin A全合成中的关键步,一步构建该天然产物分子的多环骨架结构,共7步实现了其全合成.     

3′-末端氧化的tRNA~(Leu)对大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶的亲和标记

本文用3′-末端氧化的tRNA~(Leu)(tRNA_(ox)~(Leu))专一地标记了大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)。合成酶标记上等摩尔tRNA_(ox)~(Leu)后,氨酰化活力完全丧失,同时氨基酸活化活力也失去80％。这样失活反应是通过tRNA_(ox)~(Leu)的3′-末端羰基与亮氨酰-tRNA合成酶活性中心或其附近的赖氨酸残基的ε-氨基形成Schiff碱实现的。Schiff碱经硼氢氰化钠还原后稳定。酶与tRNA_(ox)~(Leu)的共价复合物经牛胰核糖核酸酶充分水解后,其活化氨基酸的活力及动力学常数基本恢复到原来水平,而氨基酰化活力未恢复。表明了该合成酶的两种活性中心相互关联又有区别。     

用3′末端氧化的精氨酸tRNA亲和标记大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶

用3′末端氧化的精氨酰tRNA共价修饰大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶,酶的ATP-PPi交换活力和氨酰化活力完全丧失。用SDS-PAGE分析酶与tRNA(?)形成的共价复合物发现:伴随着酶的失活,形成了两种形式明显不同的ArgRS-tRNA(?)复合物,它们对应于凝胶上两条迁移率不同的大分子条带。这一结果与其它合成酶亲和标记的结果不同。ArgRS-tRNA(?)经RNase处理后,ATP-PPi交换活力和氨酰化活力均有部分恢复(小于15％)。在整个标记过程中,酶的两个活力是紧密相关联的。     

大环二萜天然产物(±)-Sinulariol-A的全合成

以香叶醇为起始原料,经多步反应完成了西松烷型大环二萜类天然产物(±)-Sinulariol-A的全合成.合成的关键步骤是醛5与丙烯酸甲酯经改进的Morita-Baylis-Hillman加成以及二价铬诱导的烯丙基氯化物与醛的分子内加成环化     

亮氨酰-tRNA合成酶的限制性酶解及活性片段的研究

大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)经胰蛋白酶限制性酶解,被切去约6k分子量肽段,产生一96k片段。该片段具有与天然酶相同的氨基酸活化反应的动力学常数,但丧失氨酰化活性、tRNA~(Leu)结合活性等由tRNAL~(Leu)参与的一系列活性。N-末端分析表明切去的6k肽段系LeuRS C端部分,该部分是LeuRS结合tRNAL~(Leu)所必需的。本文表明LeuRS的氨基酸活化和氨酰化这两种活性是相互独立并分别处于酶分子不同的结构域。LeuRS C端部分可能是tRNA~(Leu)的结合部分。     

Ⅱ.从天然胰岛素A及B链重合成结晶胰岛素

天然胰岛素的拆合(以下简称拆合)就是指:用化学办法将天然胰岛素分子的三个硫硫键打开,将胰岛素分子分为没有生物活力的A、B两条肽链,然后,经过适当处理使     

配体间相互作用研究: 氨基酸与二肽配体形成 质子复合物的稳定性

用pH电位滴定法测定了苯丙氨酰亮氨酸(PL)与甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)在离子强度为0.1mol/L(NaNO~3),(25.0±0.1)℃时形成质子复合物的稳定常数,并对苯丙氨酰亮氨酸与六种氨基酸相互作用体系进行了量子化学和分子力学计算。从配体间弱相互作用的观点,讨论了二肽配体对氨基酸分子的识别。结果表明,二肽与氨基酸配体间的结合主要受到配体间静电、氢键作用的控制,同时受到范德华力和键间排斥能等弱相互作用的影响。     

Rugosinone的全合成

以1,2,3-三甲氧基苯和3,4-亚甲二氧基苯甲醛为起始原料,经Vilsmeier反应、还原、氯化、氰解、水解、酰化、Bischler-Napieralski反应、氧化及BCl3选择性脱甲基等反应,完成了天然产物Rugosinone的全合成,总收率20.2%,其结构经1H NMR,13C NMR,MS和HR-ESI-MS确证。     

(—)-Isochaetominine推测结构的对映选择性全合成与结构修正

报道生物碱isochaetominine推测结构8的对映选择性全合成与结构修正.采用立体多样性合成策略,通过L-色氨酸与L-丙氨酸苄酯组合,以DMDO氧化启动的串联反应为关键反应,经5步高效地完成了isochaetominine推测结构8及其立体异构体(+)-2,3,14-tri-epi-chaetominine(12)的全合成.基于本实验室此前有关毛壳菌素(1)立体多样性合成的工作,天然isochaetominine的结构修正为(-)-11-epi-chaetominine(18).我们此前已完成了该天然产物的首次对映选择性全合成(从L-色氨酸出发,5步,总产率31.6%).此外,通过研究色氨酸与缬氨酸叔丁酯组合,建立了isochaetominine C三个非对映立体异构体的立体多样性合成.最后,证实了化合物13B无法进行C(14)位定点差向异构化,但可以进行C(11)和C(14)双差向异构化.     

配体间相互作用研究: 氨基酸与二肽配体形成 质子复合物的稳定性

用pH电位滴定法测定了苯丙氨酰亮氨酸(PL)与甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)在离子强度为0.1mol/L(NaNO~3),(25.0±0.1)℃时形成质子复合物的稳定常数,并对苯丙氨酰亮氨酸与六种氨基酸相互作用体系进行了量子化学和分子力学计算。从配体间弱相互作用的观点,讨论了二肽配体对氨基酸分子的识别。结果表明,二肽与氨基酸配体间的结合主要受到配体间静电、氢键作用的控制,同时受到范德华力和键间排斥能等弱相互作用的影响。     

生物化学家王德宝教授

酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_Y~(Ala))的人工全合成获得了1987年国家自然科学一等奖。用人工方法合成重要的生物大分子(蛋白质、RNA 和 DNA)是人类合成生命的前提,也是验证这些化合物结构的最好方法。由于生