大鼠肝星形细胞的分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2／3肝切除（pafital hepatectomy，PH）模型，用两步灌流法分散肝脏细胞，用60％Percoll梯度离心和免疫磁珠相结合分离肝星形细胞，用结蛋白（desmin，DES）和波形蛋白（vimentin，vIM）的免疫组织化学定性、定位再生肝（regenerating liver，RD、分散的肝脏细胞及分离的肝星形细胞，用RT—PCR定量肝星形细胞的DES和VIM mRNA，用蛋白免疫印迹定量肝星形细胞DES和VIM．初步证实，分离的肝星形细胞中DES和VIM阳性细胞占95％以上，从PH后各时间点分离的肝星形细胞的DES和VIM mRNA量稳定，相应的蛋白量亦稳定．表明改进的分离肝星形细胞方法具有收率和纯度高、活性好等特点，值得采用．     

大鼠肝库普弗细胞的分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2／3肝切除（partial hepatectomy,PH）模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60％Percoll梯度离心结合免疫磁珠方法分离库普弗细胞（Kupffer cell,KC）,用外胚层发育不良抗原2（ectodermal dysplasia antigen2,ED2）和溶菌酶（lysozyme,LYZ）的免疫组织化学方法定性、定位再生肝（regenerating liver,RL）、分散的肝脏细胞及分离的库普弗细胞,用RT—PCR定量库普弗细胞的ED2和LYZmRNA,用蛋白免疫印迹方法定量库普弗细胞的ED2和LYZ蛋白．初步证实,分离的肝库普弗细胞中ED2和LYZ阳性细胞占96％以上,从PH后各时间点分离的库普弗细胞ED2和LYZmRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定。表明改进的分离库普弗细胞方法具有收率和纯度高、活性好等优点,值得采用．     

大鼠肝窦内皮细胞的分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2／3肝切除（parital hepatectomy,PH）模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60％ Percoll梯度离心和免疫磁珠分离肝窦内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelial cell,SEC）,用分化抗原簇14（cluster of differentiation 14,CD14）和内皮素-1（endothelin-1,ET-1）的免疫组织化学定性、定位再生肝（regenerating liver,RL）、分散的肝脏细胞及分离的窦内皮细胞,用RT—PCR定量窦内皮细胞的CDl1和ET-1的mRNA,用蛋白免疫印迹方法定量窦内皮细胞的CD14和ET-1蛋白．初步证实,分离的窦内皮细胞中CD14和ET-1阳性细胞占95％以上,从PH后各时间点分离的窦内皮细胞的CD14和ET-1mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定．表明改进的分离窦内皮细胞方法具有收率和纯度高、活性好等特点,值得采用．     

大鼠肝陷窝细胞分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2／3肝切除（parital hepatectomy,PH）模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60％ Percoll梯度离心结合免疫磁珠方法分离陷窝细胞（pit cell）,用分化抗原簇8（cluster of differentiation 8,CD8）和分化抗原簇56（cluster of differentiation 56,CD56）的免疫组织化学方法定性、定位再生肝（regenerating liver,RD、分散的肝脏细胞及分离的肝陷窝细胞,用RT—PCR定量肝陷窝细胞的CD8和CD56mRNA,用蛋白免疫印迹定量肝陷窝细胞的CD8和CD56蛋白．初步证实,分离的肝陷窝细胞中,CD8和CD56阳性细胞占95％以上;PH后各时间点分离的陷窝细胞的CD8和CD56的mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定．表明改进的分离陷窝细胞方法具有收率和纯度高、活性好等特点,值得采用．     

大鼠肝卵圆细胞的分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2/3肝切除（parital hepatectomy,PH）模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60%Percoll梯度离心给合免疫磁珠分离方法卵圆细胞（oval cell,OC）.用卵圆细胞标志蛋白OC2和OV6的免疫组织化学方法定性、定位再生肝（regenerating liver,RL）、分散的肝脏细胞及分离的卵圆细胞,用RT-PCR定量卵圆细胞的OC2和OV6 mRNA,用蛋白免疫印迹方法定量卵圆细胞的OC2和OV6蛋白.初步证实分离的肝卵圆细胞中,OC2和OV6阳性细胞占96%以上,从PH后各时间点分离的肝卵圆细胞的OC2和OV6 mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定.表明改进的分离肝卵圆细胞方法具有收率和纯度高、活性好等优点,值得采用.     

大鼠胆管上皮细胞的分离、鉴定及纯度、活性分析

按Higgins等方法制作大鼠2/3肝切除(parital hepatectomy,PH)模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,在32%～90%Perco11密度梯度离心法的基础上进一步用免疫磁珠分离胆管上皮细胞(biliary epithelial cell,BEC),用γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transferase,GGT)和角蛋白19(cyto-keratin19,CK19)免疫组织化学定性、定位再生肝(regenerating liver,RL)、分散的肝脏细胞及分离的胆管上皮细胞,用RT-PCR定量胆管上皮细胞的GGT和CK18mRNA,用蛋白免疫印迹定量胆管上皮细胞的GGT、角蛋白18(cytokeratin 18,CK18).初步证实分离的细胞中GGT和CK19阳性细胞占96%以上,从PH后各时间点分离的胆管上皮细胞的GGT和CK18mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定.表明改进的分离胆管上皮细胞方法具有收率和纯度高、活性好等特点,方便适用.     

大鼠肝细胞的快速分离和原代培养

本文介绍一种快速分离大鼠正常肝细胞的方法,从刺杀动物到接种肝细胞总共只需用二小时。接种培养后,在有地塞米松的培养基内,肝主质细胞能存活到一周左右。从32例大鼠分别取材的肝细胞培养中,11例(34%)两周内出现克隆性增殖上皮细胞集落,其中的8例(25%)四周内长成汇合状态。所有能长成汇合状态的细胞群体都来源于150g以下的大鼠。本文对肝细胞的两种主要类型以及它们的亲缘关系进行了讨论。     

大鼠原代肝星形细胞的分离与鉴定

本文通过二步原位灌注的方法分离得到大鼠肝脏,随后通过机械剪切,用0.2g/L链霉蛋白酶E,0.2g/L胶原酶Ⅳ以及0.1g/L DNaseⅠ消化和分散,筛网过滤、经130g/L Nycodenz密度梯度离心后收集肝星状细胞,经台盼蓝染色后用细胞计数仪鉴定细胞存活率,α-SMA(平滑肌动蛋白)免疫细胞化学染色法鉴定肝星状细胞纯度。结果显示,肝星状细胞的得率为每个肝脏3.5×107个细胞以上,肝星状细胞纯度为95%左右,肝星状细胞存活率为(97.0±3.2)%,满足实验需要。     

大鼠原代肝细胞的标记和移植方法

探讨CM-DiI标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度、细胞的移植量和移植途径.采用原位胶原酶灌注和密度梯度离心法分离、纯化大鼠肝细胞,用不同浓度CM-DiI进行标记,筛选出CM-DiI的最佳标记浓度,分别从门静脉、尾静脉移植到2/3肝切除0h大鼠,对细胞移植36h后的肝组织石蜡切片和冰冻切片分别进行免疫组织化学分析和荧光观察.结果显示,4μmol·mL-1浓度的CM-DiI和肝细胞孵育5min,细胞标记率高达95%.每克大鼠残肝移植0.8mL的细胞悬液(107个·mL-1)和0.2,0.4,0.6mL移植后检测到的标记细胞数目相比有显著性差异(P0.01),经肝门静脉移植后可以检测到的标记细胞数比尾静脉多(P0.01).CM-DiI标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度为4μmol·mL-1,标记细胞的最佳移植量为每克大鼠残肝移植0.8mL的细胞悬液(107个·mL-1)、最佳移植途径为经肝门静脉移植.     

大鼠肝再生中肝细胞基因表达与DNA裸露的相关性研究

为了解大鼠肝再生中肝细胞的基因表达与DNA裸露的相关性,分离大鼠肝细胞,提取裸露DNA,用SOLEXA方法对DNA测序,用BWA软件拼装测序片段,用IPA软件分析拼装的基因种类和作用,用Rat Genome230 2.0芯片检测基因的转录情况.研究表明,大鼠肝再生的12h(PH后12h),肝细胞的裸露DNA涉及16 912个基因,1 701个基因发生了有意义裸露量变化.其中,25个基因的裸露量上调,1 676个基因的裸露量下调.与Rat Genome 230 2.0芯片的检测的基因转录比对表明,肝细胞的AKR7A3,BMYC,CDC25B等26个基因的裸露量和表达量均下调,表明大鼠肝再生12h时,这些基因的表达可能受染色体结构调控.     

树突状细胞在大鼠再生肝中分布及数量变化

探讨树突状细胞在大鼠再生肝中分布及数量变化,为深入研究其在肝再生进程中的作用奠定基础.制作大鼠2/3肝切除模型(PH),用两步灌流法分散肝脏细胞,用Percoll密度梯度离心和ox62免疫磁珠分离相结合方法分离树突状细胞(DC),用免疫组织化学方法定性、定位CD86和CD103在再生肝(RL)、分散的肝脏细胞及分离的树突状细胞中分布,用蛋白免疫印迹方法定量树突状细胞的CD86和CD103,用RT-PCR定量分离的树突状细胞CD86和CD103的mRNA.结果表明,0 h再生肝树突状细胞分布于肝血窦、中央静脉、胆管周围,12 h在远离中央静脉和胆管的部位出现,24 h呈弥散状分布,168 h分布与对照相同;从肝切除后0、2、6、12、24、30、36、72、120、168 h等10个时间点的大鼠再生肝中收获的树突状细胞平均数分别为每只大鼠1.55、1.59、1.87、2.46、1.49、2.73、3.87、6 04、6 52、8 40 百万个,CD86和CD103阳性细胞数目、细胞活性均在95%以上.上述结果说明在肝再生进程中树突状细胞的分布由肝血窦、中央静脉、胆管周围逐渐向全肝弥散,24 h弥散达到高峰,之后回落,至168 h分布与对照相同,但其数量随肝再生进程而增加.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞rMSCs的方法,检测传代细胞的细胞周期,并分析部分细胞表型,对rMSCs进行初步的鉴定。方法:密度梯度离心结合贴壁培养法分离培养rMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原,流式细胞仪检测细胞周期。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,细胞周期显示90.16%P1代细胞处于G0/G1期,免疫组化结果为:CD44、CD29阳性、CD34阴性,说明培养的细胞即非造血干细胞,也非成纤维细胞。结论:本实验分离培养的细胞群与间充质干细胞的生物学特性吻合,说明密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞稳定表达CD44、CD29,是实用、可行的方法,所培养的细胞可用于细胞移植等研究。     

建立基因协同作用算法解析大鼠肝再生中基因表达丰度预示的细胞增殖活动

随着生物高通量分析技术的发展,获得基因组／蛋白组数据已较易实现．然而解析这些数据的生物学意义尚有不少困难,亟待克服．从生理反应的多样性、多步骤性、可逆性、循环性、重复性、网络性、可控性、适应性等特点入手,以基因表达丰度为基础,根据时间序列分析原理,应用皮尔森相关系数建立了两种描述基因协同作用的谱函数E。（￡）和巨,用它们分析基因表达丰度、表达变化预示的大鼠肝再生中肝细胞的增殖活动．结果显示,大鼠肝再生的进展阶段,即PH后12～72h肝细胞的增殖活动显著强于对照．进一步分析相关文献资料发现,上述结果与文献报道一致,表明在解析生物高通量分析数据的生物学意义方面,基因协同作用算法有一定应用价值．     

改进的大鼠肝实质细胞的快速分离及鉴定方法

介绍一种分离、鉴定肝实质细胞的新方法.采用恒流泵、不锈钢滤网等简易灌流装置,对成年大鼠进行原位灌注分离肝实质细胞;并根据肝实质细胞能组成型表达6-磷酸葡萄糖酶这一特性,采用酶细胞化学技术鉴定肝实质细胞.经本实验改进的肝实质细胞分离方法具有简便、快捷、可靠的特点,为进一步研究肝实质细胞的各种功能奠定了基础.