胍变蛋白的构象变化及尺寸排阻色谱行为

通过比较６种天然和变性蛋白的色谱行为，提出在不含盐酸胍的非变性体系中利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的构象变化。根据色谱峰数可以判断蛋白质变性时形成变体的数目；利用峰高可以描述蛋白质变性的完全程度；根据不同波长下峰高的变化可以推断蛋白质表面氨基酸残基暴露情况；利用保留时间可以比较各种变体相对体积的大小。     

利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的变性

通过比较蛋白质变性时的色谱行为和生物物理特性，提出利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质变性时的构象变化，根据色谱参数中保留时间，比较蛋白质变性时体积的相对变化，利用色谱峰数，确定形成变体的数目，根据峰形和峰数的变化，描述蛋白质的伸展程度，利用不同波长下峰高的变化，推断蛋白质变性芳香族基酸残基的暴露情况，利用建立的尺寸排阻色谱观察了液体和固液α－淀粉酶在低温下放置时的变性情况，讨论了变性时间和变性温度对蛋白     

蛋白质在固定Zn2+金属螯合亲和色谱中的变性热力学

在15~85℃宽温度范围,研究了蛋白质在固定Zn2 金属螯合色谱系统中的热行为和变性热力学。实验结果表明,蛋白质在色谱过程都有一个固定的热转变温度:核糖核酸酶(RNase)、α-胰凝乳蛋白酶原A(α-Chy)的热转变温度约为55℃,细胞色素C(Cyt-C)和溶菌酶(Lys)约为65℃;,热转变温度的出现标志蛋白质构象发生变化;利用Van′tHoff作图测定了蛋白质在色谱系统热变性时的标准焓变ΔH°和标准熵变ΔS°,提出用标准熵变ΔS°和自由能变ΔG°判断蛋白质构象变化;利用ΔH°-ΔS°的线性关系估算了蛋白质热变性时的补偿温度,鉴定了蛋白质各变体在金属螯合色谱中保留机理的同一性,RNase、Cyt-C、Lys和α-Chy的补偿温度分别为55℃、65.8℃、65.2℃和54.8℃;根据蛋白质热变性时的补偿温度和构象变化熵变Δ(ΔS°)的大小,讨论了蛋白质在阳离子交换色谱和固定Zn的金属螯合色谱体系中的热稳定性。实验证明,在IDA裸柱引入Zn2 后蛋白质在色谱系统中的热稳定性减小,平均补偿温度从65.3℃降低到59.7℃,而构象变化熵变的绝对值大幅度升高。     

蛋白质在合成阳离子交换剂上的色谱特性研究

用国产材料按间接法合成了螯合型弱阳离子交换剂,详细研究了合成填料的色谱性能,并与商品柱的分离效能进行了比较;在宽温度范围内研究了蛋白质在弱阳离子交换系统中的色谱热力学,测定了蛋白质在色谱过程变性时的热力学参数 (△H0和△S0) 和补偿温度β,提出用标准熵变△S0判断蛋白质的构象变化和用△H0与△S0的补偿关系鉴定蛋白质各变体在色谱系统保留机理的同一性。考察了螯合型弱阳离子交换剂与金属离子的作用,研究了蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理。     

比较纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱用于自顶向下蛋白质组学

自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。     

溶液中蛋白质寡聚态的表征分析

分析溶液中蛋白质的寡聚态,是研究其结构和功能的必要前提和基础.目前常用的生化实验方法有非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、体积排阻色谱、光散射法和分析超速离心法等,基本属于定性或半定量分析,精准性不足.此外,液体核磁共振和非变性质谱方法也可以对蛋白质的寡聚态进行表征分析.为了综合分析和比较不同方法的异同,我们应用体积排阻色谱、液体核磁共振和非变性质谱,对研究条件下以单体和二聚体存在为主的蛋白质TGIF1-HD和SP_0782进行了寡聚态的分析.结果表明,体积排阻色谱和液体核磁共振可以估算蛋白质的分子量及不同寡聚态的相对比例,液体核磁共振还可以提供蛋白质折叠及是否存在不同构象等信息,而非变性质谱在定量分析方面独具优势.     

蛋白质在疏水色谱中的变性热力学

研究21-80℃温度范围内一些蛋白质和小分子在疏水相互作用色谱中的热行为。利用Van't Hoff作图(lnk'-1/T)测定蛋白质分子的热力学参数(ΔH°, ΔS°和ΔG°), 根据标准熵变(ΔS°)和标准自由能变(ΔG°)判断蛋白质在色谱过程中的构象变化, 通过ΔH°-ΔS°的线性关系估计蛋白质变性时的"补偿温度"(β), 鉴定蛋白质在疏水相互作用色谱中保留机理的同一性。     

基于在线二维色谱的不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析

建立了基于在线二维弱阴离子交换色谱-反相液相色谱(2D-WAX-RPLC)的蛋白质分离系统,并用于不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析。以5种标准蛋白质的混合物为样品,考察了系统的重现性。通过改变标准蛋白质之间的浓度比,研究了该系统进行蛋白质相对定量的能力。在此基础上,针对4个不同生长时期的鹿茸样品,分别采用5种不同的方法进行蛋白质提取,经2D-WAX-RPLC分离后,收集各生长时期对应蛋白质的峰高最大比超过2的组分。酶解后,采用微柱反相液相色谱-串联质谱(μRPLC-MS/MS)进行肽段的分离鉴定;共从9个差异蛋白质峰中鉴定到了22个差异蛋白质。研究结果表明,利用基于蛋白质水平的在线二维液相色谱分离技术找寻差异蛋白质,具有重现性好、自动化程度高等优点,可用于开展比较蛋白质组学的研究。     

利用色谱法研究α－淀粉酶变性动力学

提出用尺寸排阻色谱法研究酶的变性动力学。此法将高效色谱分离同灵敏的紫外检测结合起来,消除了紫外法测定蛋白质变性速度时变性体的影响。确定了个淀粉酶在盐酸胍溶液中变性时的反应级数,测定了不同浓度变性剂中酶的变性速度常数,并和失活速度常数进行了比较,讨论了影响酶变性速度的因素。     

基于ProteinGoggle 2.0的组蛋白H4蛋白质变体的自上而下表征

由于大量可能蛋白质变体以及每一个翻译后修饰大量可能位点的存在,核心组蛋白上密集的组合式翻译后修饰的自上而下表征一直是一个巨大的分析挑战。结合高分辨串级质谱,基于同位素质荷比和轮廓指纹比对的整体蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle 2.0在组蛋白翻译后修饰的自上而下鉴定方面拥有诸多独特的优势。该文报道ProteinGoggle 2.0对HeLa核心组蛋白H4的数据库搜索及蛋白质变体的鉴定结果。基于从UniProt网站下载的人类核心组蛋白H4的纯文本文件和“鸟枪法”注释,ProteinGoggle 2.0首先创建包含所有可能蛋白质变体的理论数据库;从纯文本文件中提取的信息主要是氨基酸序列、可能的翻译后修饰（单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和磷酸化）及氨基酸变异（A77→P）。在控制质谱水平假阳性率低于1%的前提下,共鉴定到426个蛋白质变体,这是目前为止H4蛋白质变体的最全报道。这些ProteinGoggle 2.0鉴定到的H4蛋白质变体也与之前报道的ProSightPC 2.0的鉴定结果进行了肩并肩比较。总而言之,ProteinGoggle 2.0可以对具有复杂组合修饰及氨基酸变异的蛋白质组进行数据库搜索和蛋白质变体鉴定。     

脲或盐酸胍溶液中变性溶菌酶复性过程中集聚体的研究

建立在蛋白质变性-复性三态模型的基础上, 给出了一个描述在变性液中变性蛋白质复性时蛋白质浓度和其复性率的关系式. 通过这个关系式, 可以获得两个重要的描述蛋白质变性-复性体系特征的参数, 一个是包含在一个集聚体分子中的变性蛋白质的分子数目n, 另一个是蛋白质从原始态到形成集聚体过程中的表观集聚平衡常数K. 以三种溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的变性-复性过程对此方程进行了验证, 结果表明所给出的方程能够很好地描述三种溶菌酶在这两种变性液中的复性结果, 三种溶菌酶在两种变性液中有形成二分子集聚体的趋势. 变性溶菌酶在复性过程中的电泳和高效凝胶排阻色谱也同时能够监测到复性过程中集聚体的形成, 并且监测结果与上述方程所得的结果一致.     

利用色谱法研究α—淀粉酶变性动力学

提出用尺寸排阻色谱法研究酶的变性动力学。此法将高效色谱分离同灵敏的紫外检测结合起来，消除了紫外法测定蛋白质变性速度时变性体的影响。确定了α－淀粉酶在盐酸胍溶液中变性时的反应级数。测定了不同浓度变性剂中酶的变性速度常数，并和答活速度常数进行了比较，讨论了影响酶变性速度的因素。     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现,两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时,得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现，两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时，得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

基于ProteinGoggle 2.0的组蛋白H4蛋白质变体的自上而下表征（英文）

由于大量可能蛋白质变体以及每一个翻译后修饰大量可能位点的存在,核心组蛋白上密集的组合式翻译后修饰的自上而下表征一直是一个巨大的分析挑战。结合高分辨串级质谱,基于同位素质荷比和轮廓指纹比对的整体蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle 2.0在组蛋白翻译后修饰的自上而下鉴定方面拥有诸多独特的优势。该文报道ProteinGoggle 2.0对HeLa核心组蛋白H4的数据库搜索及蛋白质变体的鉴定结果。基于从UniProt网站下载的人类核心组蛋白H4的纯文本文件和"鸟枪法"注释,ProteinGoggle 2.0首先创建包含所有可能蛋白质变体的理论数据库;从纯文本文件中提取的信息主要是氨基酸序列、可能的翻译后修饰(单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和磷酸化)及氨基酸变异(A77→P)。在控制质谱水平假阳性率低于1%的前提下,共鉴定到426个蛋白质变体,这是目前为止H4蛋白质变体的最全报道。这些ProteinGoggle 2.0鉴定到的H4蛋白质变体也与之前报道的ProSightPC 2.0的鉴定结果进行了肩并肩比较。总而言之,ProteinGoggle 2.0可以对具有复杂组合修饰及氨基酸变异的蛋白质组进行数据库搜索和蛋白质变体鉴定。     

微柱高效液相色谱-质谱/质谱快速鉴定混合蛋白质新方法

发展了一种混合蛋白质快速鉴定的新方法.将几种蛋白质的混合物于热变性后直接在溶液中酶解,利用微柱高效液相色谱-离子阱串级质谱进行肽谱/氨基酸序列分析,并结合Mascot数据库搜索处理功能,实现了混合蛋白质快速准确的鉴定.     

蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展

生物大分子是近年来生命科学的研究热点和难点之一,而对蛋白质变性的研究有助于深刻揭示生命现象的机理.利用光谱学和热力学可以分别从微观和宏观角度对蛋白质变性进行研究,并由此得到表征蛋白质变性的热力学参数.这对深入了解蛋白质的折叠与伸展、变性机理、结构稳定性及生命体的新陈代谢等问题具有很大意义.近年来,国内外学者在此方面做了大量的工作,主要涉及蛋白质在水溶液中的变性机理、在有变性剂存在下水溶液中的变性机理及在含有其它物质水溶液中的变性机理.用来表征蛋白质变性的热力学参数有热容、变性自由能、变性焓和变性熵等.本文对这些研究进行了概述.     

气相色谱峰高定量校正因子的探讨

 〕在同一操作条件下流出的等量同系物组分，它们的色谱峰高与其保留值之间的关系可用双曲线方程来表示。据此，提出利用保留值来估算同系物组分的峰高定量校正因子。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析

 将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ经盐酸胍变性30 min后,在pH 3.0、反应温度为37 ℃的条件下与三羧甲基磷酸(TCEP)反应12 min,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。 根据其保留时间,分析虎纹毒素-Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析

将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅴ经盐酸胍变性 30min后 ,在pH 3 0、反应温度为 37℃的条件下与三羧甲基磷酸 (TCEP)反应 12min ,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体 ,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行鉴定 ,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。根据其保留时间 ,分析虎纹毒素 Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为 ,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。